NORMA Oficial Mexicana NOM-127-SSA1-2021, Agua para uso y consumo humano. Límites permisibles de la calidad del agua.

Al margen un sello con el Escudo Nacional, que dice: Estados Unidos Mexicanos.- SALUD.- Secretaría de Salud.

ALEJANDRO ERNESTO SVARCH PÉREZ, Comisionado Federal para la Protección contra Riesgos Sanitarios y Presidente del Comité Consultivo Nacional de Normalización de Regulación y Fomento Sanitario, con fundamento en lo dispuesto por los artículos 39 de la Ley Orgánica de la Administración Pública Federal; 4 de la Ley Federal de Procedimiento Administrativo; 3o, fracción XIII, 13, apartado A, fracción I, 17 bis, fracciones II y III, 116, 118, fracción II y 119, fracción II de la Ley General de Salud; 38, fracción II, 40, fracción I, 43 y 47, fracción IV de la Ley Federal sobre Metrología y Normalización; 28 del Reglamento de la Ley Federal sobre Metrología y Normalización; 209 a 213, 214, fracciones I, II, III y V, 215 a 225 y 227 del Reglamento de la Ley General de Salud en Materia de Control Sanitario de Actividades, Establecimientos, Productos y Servicios; así como 3, fracciones I, incisos n), o) y s), y II, 10, fracción IV del Reglamento de la Comisión Federal para la Protección contra Riesgos Sanitarios y,

CONSIDERANDO

Que en cumplimiento a lo previsto en el artículo 46, fracción I de la Ley Federal sobre Metrología y Normalización, el 28 de junio de 2017, el Comité Consultivo Nacional de Normalización de Regulación y Fomento Sanitario, aprobó el anteproyecto de la presente Norma;

Que con fecha 6 de diciembre de 2019, en cumplimiento a lo previsto en el artículo 47, fracción I de la Ley Federal sobre Metrología y Normalización, se publicó en el Diario Oficial de la Federación, el Proyecto de Norma Oficial Mexicana PROY-NOM-127-SSA1-2017, Agua para uso y consumo humano. Límites permisibles de la calidad del agua, a efecto de que dentro de los sesenta días naturales posteriores a dicha publicación, los interesados presentaran sus comentarios al Comité Consultivo Nacional de Normalización de Regulación y Fomento Sanitario;

Que con fecha previa, fueron publicadas en el Diario Oficial de la Federación, las respuestas a los comentarios recibidos por el mencionado Comité, en términos del artículo 47, fracción III de la Ley Federal sobre Metrología y Normalización;

Que con fecha 24 de agosto del 2021, el Comité Consultivo Nacional de Normalización de Regulación y Fomento Sanitario aprobó la presente Norma Oficial Mexicana;

Que la Secretaría de Salud ha dado cumplimiento a lo establecido en el artículo 78 de la Ley General de Mejora Regulatoria, con la reserva por la desregulación de la reducción analítica de la materia prima para la elaboración de dispositivos médicos obtenidos de la publicación de la NOM-241-SSA1-2021, Buenas Prácticas de Fabricación de Dispositivos publicada en el Diario Oficial de la Federación el 17 de diciembre de 2021, lo cual  se desglosa en el Análisis de Impacto Regulatorio correspondiente; y

Que en atención a las anteriores consideraciones, he tenido a bien expedir y ordenar la publicación en el Diario Oficial de la Federación, de la

NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-127-SSA1-2021, AGUA PARA USO Y CONSUMO HUMANO.  LÍMITES PERMISIBLES DE LA CALIDAD DEL AGUA

PREFACIO

En la elaboración de esta Norma participaron:

SECRETARÍA DE SALUD

Comisión Federal para la Protección contra Riesgos Sanitarios

SECRETARÍA DE MEDIO AMBIENTE Y RECURSOS NATURALES

Comisión Nacional del Agua

Instituto Mexicano de Tecnología del Agua

SECRETARÍA DE ENERGÍA

Comisión Nacional de Seguridad Nuclear y Salvaguardias

SISTEMA DE AGUAS DE LA CIUDAD DE MÉXICO

Subdirección de Control de la Calidad del Agua

COMISIÓN DEL AGUA DEL ESTADO DE MÉXICO

Departamento del Laboratorio del Agua

SERVICIOS DE AGUA Y DRENAJE DE MONTERREY, I.P.D.

Laboratorio Central de Calidad de Aguas

ORGANIZACIÓN MUNDIAL DE LA SALUD

Organización Panamericana de la Salud

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

Instituto de Ecología

Laboratorio Nacional de Ciencias de la Sostenibilidad

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

Escuela Nacional de Ciencias Biológicas

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE SAN LUIS POTOSÍ

Centro de Investigación Aplicada en Ambiente y Salud

Confederación de Cámaras Industriales de los Estados Unidos Mexicanos

Confederación Patronal de la República Mexicana

Cámara Nacional de la Industria de Transformación

Asociación Nacional de Empresas de Agua y Saneamiento de México, A.C.

Laboratorios ABC Química Investigación y Análisis, S.A. de C.V.

Laboratorios de Especialidades Inmunológicas, S.A. de C.V.

ÍNDICE

0.        Introducción.

1.        Objetivo y campo de aplicación.

2.        Referencias normativas.

3.        Términos y definiciones.

4.        Símbolos y términos abreviados.

5.        Especificaciones sanitarias.

6.        Métodos de prueba.

7.        Concordancia con normas internacionales.

8.        Procedimiento de evaluación de la conformidad.

9.        Bibliografía.

10.        Observancia de la Norma.

11.        Vigencia.

       Apéndice A Normativo. Parámetros que conforman los grupos de compuestos orgánicos sintéticos.

       Apéndice B Normativo. Métodos de prueba.

       Apéndice C Informativo. Procesos propuestos para la potabilización del agua.

0. Introducción

El abastecimiento de agua para uso y consumo humano con calidad adecuada es fundamental para prevenir y evitar la transmisión de enfermedades relacionadas con el agua, para lo cual se requiere establecer y mantener actualizados los límites permisibles en cuanto a sus características físicas, químicas, microbiológicas, y radiactivas, con el fin de asegurar y preservar la calidad del agua que se entrega al consumidor por los sistemas de abastecimiento de agua públicos y privados.

Por tales razones la Secretaría de Salud, propone la emisión de la presente Norma Oficial Mexicana, con la finalidad de establecer un eficaz control sanitario del agua que se somete a tratamientos de potabilización a efecto de hacerla apta para uso y consumo humano, acorde a las necesidades actuales.

1. Objetivo y campo de aplicación

1.1 Esta Norma establece los límites permisibles de calidad que debe cumplir el agua para uso y consumo humano.

1.2 Esta Norma es de observancia obligatoria en el territorio nacional para los organismos responsables de los sistemas de abastecimiento de agua públicos y privados.

1.3 Esta Norma no es aplicable para aguas residuales tratadas.

2. Referencias normativas

Para la correcta aplicación de esta Norma, es necesario consultar las siguientes normas oficiales mexicanas o las que las sustituyan:

2.1 Norma Oficial Mexicana NOM-008-SCFI-2002, Sistema General de Unidades de Medida.

2.2 Norma Oficial Mexicana NOM-117-SSA1-1994, Bienes y servicios. Método de prueba para la determinación de cadmio, arsénico, plomo, estaño, cobre, fierro, zinc y mercurio en alimentos, agua potable y agua purificada por espectrometría de absorción atómica.

2.3 Norma Oficial Mexicana NOM-179-SSA1-2020, Agua para uso y consumo humano. Control de la calidad del agua distribuida por los sistemas de abastecimiento de agua.

2.4 Norma Oficial Mexicana NOM-201-SSA1-2015, Productos y servicios. Agua y hielo para consumo humano, envasados y a granel. Especificaciones sanitarias.

2.5 Norma Oficial Mexicana NOM-210-SSA1-2014, Productos y servicios. Métodos de prueba microbiológicos. Determinación de microorganismos indicadores. Determinación de microorganismos patógenos.

3. Términos y definiciones

Para los propósitos de esta Norma, se aplican los términos y definiciones siguientes:

3.1 Agua para uso y consumo humano, a toda aquella que no causa efectos nocivos a la salud y que no presenta propiedades objetables o contaminantes en concentraciones fuera de los límites permisibles y que no proviene de aguas residuales tratadas.

3.2 Aguas residuales, a las de composición variada, provenientes de las descargas de usos público, urbano, doméstico, industrial, comercial, de servicios, agrícola, pecuario, de las plantas de tratamiento y en general, de cualquier uso, así como la mezcla de ellas.

3.3 Agua superficial, a la que fluye sobre la superficie del suelo a través de arroyos, canales y ríos, o que se almacene en lagos, embalses, ya sean naturales o artificiales.

3.4 Brote, a la ocurrencia de dos o más casos asociados epidemiológicamente entre sí. La existencia de un caso único bajo vigilancia especial en un área donde no existía el padecimiento se considera también como brote.

3.5 Coliforme termotolerante, tradicionalmente llamados coliformes fecales, los cuales se identifican por su capacidad de fermentar la lactosa con producción de gas a 44.5°C en 24 h.

3.6 Compuestos orgánicos halogenados adsorbibles fijos, al grupo de parámetros analíticos que comprende compuestos orgánicos con halógenos que no son volátiles.

3.7 Compuestos orgánicos halogenados adsorbibles purgables, al grupo de parámetros analíticos que comprende compuestos orgánicos con halógenos que son volátiles.

3.8 Compuestos orgánicos no halogenados, al grupo de parámetros analíticos que comprende compuestos orgánicos semivolátiles sin halógenos.

3.9 Desinfección, al proceso físico y/o químico utilizado para la eliminación, inactivación o destrucción de microorganismos patógenos en el agua.

3.10 Emergencia, a cualquier incidente o accidente en los componentes del sistema de abastecimiento de agua, que dé lugar a alteraciones en la calidad del agua que represente un riesgo a la salud de la población.

3.11 Límite permisible, al valor máximo o intervalo de valores establecidos para los parámetros físicos, químicos, microbiológicos o radiactivos, que no deben excederse en el agua para uso y consumo humano.

3.12 Método de prueba, al procedimiento analítico utilizado en el laboratorio para comprobar que el agua satisface las especificaciones de esta Norma.

3.13 Organismo responsable, a la instancia encargada de operar, mantener y administrar el sistema de abastecimiento de agua con el fin de asegurar y preservar la calidad del agua que se entrega al consumidor por los sistemas de abastecimiento de agua públicos y privados, estableciendo un eficaz control sanitario del agua sometiéndola a tratamientos de potabilización a efecto de hacerla y mantenerla apta para uso y consumo humano.

3.14 Potabilización, al conjunto de operaciones y procesos, físicos, químicos y biológicos que se aplican al agua en los sistemas de abastecimiento de agua, a fin de hacerla apta para uso y consumo humano.

3.15 Sistema de abastecimiento de agua, al conjunto intercomunicado o interconectado de fuentes, obras de captación, plantas potabilizadoras, tanques de almacenamiento y regulación, líneas de conducción y distribución, incluyendo vehículo cisterna que abastece de agua para uso y consumo humano, sean de propiedad pública o privada.

4. Símbolos y términos abreviados

Cuando en esta Norma se haga referencia a los siguientes símbolos y abreviaturas, se entiende por:

4.1        Bq        becquerel

4.2        Bq/L        becquerel por Litro

4.3        CaCO3        carbonato de calcio

4.4        DDT        diclorodifeniltricloroetano

4.5        Di        prefijo en nomenclatura química que indica que el sustituyente se encuentra dos veces

4.6        E. coli        Escherichia coli

4.7        F-        ión fluoruro

4.8        L        litro

4.9        LR        levo-rotativo

4.10        mg        miligramo

4.11        mL        mililitro

4.12        µg        microgramo

4.13        NMP        número más probable

4.14        N-NO3-        nitrógeno de nitratos

4.15        N-NO2-        nitrógeno de nitritos

4.16        N-NH3        nitrógeno amoniacal

4.17        pH        potencial de hidrógeno

4.18        SO4=        sulfatos

4.19        UC        unidades de color

4.20        UFC        unidades formadoras de colonias

4.21        UNT        unidades nefelométricas de turbiedad

4.22        2,4-D        ácido 2,4-diclorofenoxiacético

4.23        2,4-DB        ácido 2,4-diclorofenoxibutírico

4.24        2,4,5-T        ácido 2,4,5 triclorofenoxiacético

4.25        2,4,5-TP        ácido 2,4,5-triclorofenoxi propiónico

4.26        <        menor que

5. Especificaciones sanitarias

El agua para uso y consumo humano de los sistemas de abastecimiento debe cumplir con las siguientes especificaciones:

5.1 El agua de los sistemas de abastecimiento no debe tener como fuente de abastecimiento agua residual tratada.

5.2 Físicas:

Tabla 1 - Especificaciones sanitarias físicas

Parámetros

Límite permisible

Unidades

Turbiedad a

4.0

UNT

pH

6.5 a 8.5

Unidades de pH

Color Verdadero

15

UC

a El límite permisible para Turbiedad será de 3.0 UNT a partir del segundo año posterior a la entrada en vigor de la presente Norma.

5.3 Químicas:

Tabla 2 - Especificaciones sanitarias químicas

Parámetros

Límite permisible

Unidades

Cianuros totales

0.07

mg/L

Dureza total como CaCO3

500.00

mg/L

Fluoruros como F- a

1.50

mg/L

Nitrógeno amoniacal (N-NH3)

0.50

mg/L

Nitrógeno de nitratos (N-NO3-)

11.00

mg/L

Nitrógeno de nitritos (N-NO2-)

0.90

mg/L

Sólidos disueltos totales

1000.00

mg/L

Sulfatos (SO4=)

400.00

mg/L

Sustancias activas al azul de metileno

0.50

mg/L

a El límite permisible para fluoruros será de 1.50 mg/L para todas las localidades y se ajustará de conformidad con la tabla de cumplimiento gradual Tabla 3 de este inciso 5.3


Tabla 3 - Tabla de cumplimiento gradual para fluoruro

Localidad

Año

Límite permisible

Unidades

Mayor de 500,000 habitantes

Un año posterior a la entrada en vigor de la presente Norma

1.0

mg/L

Entre 50,000 y 499,999 habitantes

Tres años posterior a la entrada en vigor de la presente Norma

1.0

mg/L

Menor de 50,000 habitantes

Seis años posterior a la entrada en vigor de la presente Norma

1.0

mg/L


5.4 Metales y metaloides:

Tabla 4 - Especificaciones sanitarias de metales y metaloides

Parámetros

Límite permisible

Unidades

Aluminio

0.20

mg/L

Arsénico a

0.025

mg/L

Bario

1.3

mg/L

Cadmio b

0.005

mg/L

Cobre

2.00

mg/L

Cromo total

0.05

mg/L

Hierro

0.30

mg/L

Manganeso

0.15

mg/L

Mercurio

0.006

mg/L

Níquel

0.07

mg/L

Plomo

0.01

mg/L

Selenio

0.04

mg/L

NOTA 1 Los límites permisibles de metales y metaloides se refieren a su concentración total en el agua, la cual incluye los suspendidos y los disueltos.

a El límite permisible para arsénico será de 0.025 mg/L para todas las localidades y se ajustará de conformidad con la tabla de cumplimiento gradual Tabla 5 de este inciso 5.4.

b El límite permisible para cadmio será de 0.005 mg/L para todas las localidades y se ajustará de conformidad con la tabla de cumplimiento gradual Tabla 5 de este inciso 5.4.

Tabla 5 - Tabla de cumplimiento gradual para arsénico y cadmio

Localidad

Año

Límite permisible de arsénico

Límite permisible de cadmio

Unidades para arsénico y cadmio

Mayor de 500,000 habitantes

Un año posterior a la entrada en vigor de la presente Norma

0.01

0.003

mg/L

Entre 50,000 y 499,999 habitantes

Tres años posterior a la entrada en vigor de la presente Norma

0.01

0.003

mg/L

Menor de 50,000 habitantes

Seis años posterior a la entrada en vigor de la presente Norma

0.01

0.003

mg/L


5.5 Microbiológicas:

Tabla 6 - Especificaciones sanitarias microbiológicas

Parámetros

Límite permisible

Unidades

E. coli o Coliformes termotolerantes

<1.1 ó No detectable

NMP/100 mL

<1

UFC/100 mL

Ausencia

Ausencia o Presencia/100mL

Giardia lamblia

Ausencia

Quistes/20L

NOTA 1 El organismo responsable debe seleccionar uno de los dos parámetros para su análisis: E. coli o coliformes termotolerantes (coliformes fecales).

NOTA 2 Las unidades de medida (NMP/100mL; UFC/100mL; Ausencia o Presencia/100mL) corresponden a los tres métodos de prueba aceptados para el cumplimiento de esta Norma.

NOTA 3 Giardia lamblia debe determinarse sólo en caso de que el agua provenga de fuente superficial o que la fuente tenga influencia de agua superficial.


5.6 Fitotoxinas:

Tabla 7 - Especificaciones sanitarias de fitotoxinas

Parámetros

Límite permisible

Unidades

Microcistina-LR

1.0

µg/L

NOTA 1 La microcistina-LR se debe determinar cuando el agua proviene de una fuente superficial.


5.7 Radiactividad:

Tabla 8 - Especificaciones sanitarias de radiactividad

Parámetros

Límite permisible

Unidades

Radiactividad alfa total

0.5

Bq/L

Radiactividad beta total

1.0

Bq/L

5.8 Residuales de la desinfección:

5.8.1 Si para la desinfección del agua se utiliza algún compuesto de cloro (hipoclorito de sodio o de calcio, gas cloro o dióxido de cloro) debe medirse cloro residual libre.

5.8.2 Si para la desinfección del agua se utiliza yodo debe medirse yodo residual libre.

5.8.3 Si para la desinfección del agua se utiliza cualquier forma de plata debe medirse plata total.

Tabla 9 - Especificaciones sanitarias de residuales de la desinfección

Parámetros

Límite permisible

Unidades

Cloro residual libre

0.2 a 1.5

mg/L

Yodo residual libre

0.2 a 1.5

mg/L

Plata total

0.05 a 0.1

mg/L


5.8.4 La Secretaría de Salud determinará si un agente diferente a los establecidos en la Tabla 9 puede ser utilizado para la desinfección de agua para uso y consumo humano.

5.8.5 En caso de un brote, para garantizar la protección a la población, la Secretaría de Salud determinará el agente desinfectante del agua y el intervalo de concentración de los residuales de desinfección.

5.9 Subproductos de la desinfección.

5.9.1 Si el agua se desinfecta con algún compuesto de cloro se deben medir los subproductos de la desinfección: trihalometanos y ácidos haloacéticos, de conformidad con lo establecido en las Tablas 10 y 11 de esta Norma.

Tabla 10 - Especificaciones sanitarias de subproductos de la desinfección - trihalometanos

Parámetros

Límite permisible

Unidades

Bromodiclorometano

60

µg/L

Bromoformo

100

µg/L

Cloroformo

300

µg/L

Dibromoclorometano

100

µg/L


Tabla 11 - Especificaciones sanitarias de subproductos de la desinfección - ácidos haloacéticos

Parámetros

Límite permisible

Unidades

Ácido cloroacético

20

µg/L

Ácido dicloroacético

50

µg/L

Ácido tricloroacético

200

µg/L


5.9.2 Si el agua se desinfecta con ozono, se deben medir los subproductos de la desinfección: aniones y carbonilos, de conformidad con lo establecido en las Tablas 12 y 13 de esta Norma.

Tabla 12 - Especificaciones sanitarias de subproductos de la desinfección - aniones

Parámetros

Límite permisible

Unidades

Bromatos

10

µg/L

Cloratos

700

µg/L

Cloritos

700

µg/L


Tabla 13 - Especificaciones sanitarias de subproductos de la desinfección - carbonilos

Parámetros

Límite permisible

Unidades

Formaldehído

900

µg/L

5.10 Compuestos orgánicos sintéticos:

Tabla 14 - Especificaciones sanitarias de compuestos orgánicos sintéticos

Parámetros

Límite permisible

Unidades

Compuestos orgánicos halogenados adsorbibles fijos

0.01

mg/L

Compuestos orgánicos no halogenados

0.025

mg/L

Compuestos orgánicos halogenados adsorbibles purgables

0.005

mg/L

Compuestos orgánicos volátiles no halogenados

Benceno

10

µg/L

Estireno

20

µg/L

Etilbenceno

300

µg/L

Tolueno

700

µg/L

Xilenos

(suma de isómeros orto, meta y para)

500

µg/L


5.10.1 En caso de sobrepasar alguno de los límites permisibles de los grupos de compuestos orgánicos sintéticos de la Tabla 14 de esta Norma, el organismo responsable deberá analizar los compuestos orgánicos asociados establecidos en el Apéndice A Normativo de esta Norma correspondientes al grupo de compuestos orgánicos sintéticos que sobrepase el límite permisible.

5.11 Cuando se excedan los límites permisibles expuestos en este Capítulo, se deben aplicar los procesos de tratamiento adecuados para su remoción, entre los cuales puede aplicar el que corresponda, de los referidos en el Apéndice C Informativo de esta Norma o cualquier otro que sea efectivo para la remoción del contaminante.

5.12 En caso de alguna emergencia (ver inciso 3.9 de esta Norma), la Secretaría de Salud definirá los parámetros y límites aplicables al agua destinada para uso y consumo humano, conforme a lo dispuesto por el artículo 116 de la Ley General de Salud.

6. Métodos de prueba

6.1 Para la determinación de las especificaciones fisicoquímicas de agua, se deben aplicar los métodos que establecen las normas oficiales mexicanas citadas en los puntos 2.2 y 2.3 del Capítulo de Referencias normativas o los establecidos en el Apéndice B Normativo, Métodos de prueba de esta Norma.

6.2 Para la determinación de las especificaciones microbiológicas de agua, se deben aplicar los métodos de prueba que establece la norma oficial mexicana citada en el punto 2.3 y 2.4 del Capítulo de Referencias normativas o los establecidos en el Apéndice B Normativo Métodos de prueba de esta Norma.

7. Concordancia con normas internacionales

Esta Norma no es concordante con ninguna Norma Internacional.

8. Procedimiento de evaluación de la conformidad

La evaluación de la conformidad podrá ser solicitada a instancia de parte por el responsable sanitario, el representante legal o la persona que tenga las facultades para ello, ante la autoridad competente o las personas acreditadas y autorizadas para tales efectos.

9. Bibliografía

9.1 American Public Health Association (2012). Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, 22nd Edition. Washington D.C. EUA.

9.2 American Water Works Association (2000). Water Quality and Treatment: A Handbook of Community Water Supplies, 5th Edition, McGraw Hill Inc, USA.

9.3 Betancourt-Lineares, A., Irigoyen-Camacho, ME., Mejía-González, A., Zepeda-Zepeda, M. & Sánchez-Pérez, L. (2013). Prevalencia de Fluorósis Dental en Localidades Mexicanas Ubicadas en 27 Estados y el DF. A Seis Años de la Publicación de la Norma Oficial Mexicana para la Fluoruración de la Sal. Revista de Investigación Clínica. 65, (3) 23, pp 7-24.

9.4 Bocanegra-Salazar, M., Landín-Rodríguez, LE. & Ortíz-Pérez, MD. (2006). Tesis: Evaluación de la Contaminación por Flúor y Arsénico en el Agua de Pozo para Consumo Humano de las Zonas Centro, Altiplano y media del Estado de San Luis Potosí. Universidad Autónoma de San Luis Potosí.

9.5 Comisión Nacional del Agua (2015). Manual de Agua Potable, Alcantarillado y Saneamiento (Mapas).

9.6 Programa de las Naciones Unidas para el Medio Ambiente. 2001. Convenio de Estocolmo sobre Contaminantes Orgánicos Persistentes. UNEP.

9.7 Das K, Mondal NK. (2016). Dental fluorosis and urinary fluoride concentration as a reflection of fluoride exposure and its impact on IQ level and BMI of children of Laxmisagar, Simlapal Block of Bankura District, W.B., India. Environmental Monitoring & Assessment 188(4):218.

9.8 Environmental Protection Agency (2010). Guidelines for Design of Small Public Ground Water Systems. Fourth Edition. Division of drinking and groundwater. Ohio. p76.

9.9 Hurtado-Jiménez, R. & Gardea-Torresdey, JL. (2006). Arsenic in Drinking Water in the Los Altos de Jalisco Region of Mexico. Rev. Panam. Salud Pública. 20, (4): pp 23647.

9.10 Khan SA, et al. (2015). Relationship between dental fluorosis and intelligence quotient of school going children in and around Lucknow district: a cross-sectional study. Journal of Clinical & Diagnostic Research 9(11):ZC10-15.

9.11 Ley de Aguas Nacionales.

9.12 Loyola-Rodríguez, JP., Pozos-Guillén AJ., Hernández-Guerrero, JC. & Hernández-Sierra JF. (2000). Fluorosis en Dentición Temporal en un Área con Hidrofluorosis Endémica. Salud Pública de México. 42,  pp 194-200.

9.13 Mondal D, et al. (2016). Inferring the fluoride hydrogeochemistry and effect of consuming fluoride-contaminated drinking water on human health in some endemic areas of Birbhum district, West Bengal. Environmental Geochemistry & Health 38(2):557-76.

9.14 Norma Oficial Mexicana NOM-017-SSA2-2012. Para la Vigilancia Epidemiológica.

http://dof.gob.mx/nota_detalle.php?codigo=5288225&fecha=19/02/2013

9.15 Panduro Rivera, MG. (2015). Evaluación de la Calidad del Agua Ante la Enfermedad Renal Crónica en la Zona Oriente de Michoacán. Tesis Maestro de Maestría. Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco, AC.

9.16 Sebastian ST, Sunitha S. 2015. A cross-sectional study to assess the intelligence quotient (IQ) of school going children aged 10-12 years in villages of Mysore district, India with different fluoride levels. Journal of the Indian Society of Pedodontics and Preventive Dentistry 33(4):307-11.

9.17 Secretaría de Salud (2012). Manual de Procedimientos Estandarizados para la Vigilancia Epidemiológica de las Patologías Bucales.

http://www.cenaprece.salud.gob.mx/programas/interior/saludbucal/descargas/pdf/20_2012_Manual_PatBucales_vFinal.pdf

9.18 World Health Organization (2017). Guidelines for Drinking-Water Quality. 4a edición incorporando el primer addendum.

9.19 World Health Organization (2010). Diez sustancias químicas que constituyen una preocupación para la salud pública.

http://www.who.int/ipcs/assessment/public_health/chemicals_phc/es/

10. Observancia de la Norma

La vigilancia del cumplimiento de esta Norma corresponde a la Secretaría de Salud a través de la Comisión Federal para la Protección contra Riesgos Sanitarios y a los gobiernos de las entidades federativas, en sus respectivos ámbitos de competencia.

11. Vigencia

Esta Norma entrará en vigor a los 360 días naturales contados a partir del día siguiente de su publicación en el Diario Oficial de la Federación.

TRANSITORIO

ÚNICO.- La entrada en vigor de la presente Norma, deja sin efectos a la Modificación a la Norma Oficial Mexicana NOM-127-SSA1-1994, Salud Ambiental. Agua para uso y consumo humano. Límites permisibles de calidad y tratamientos a que debe someterse el agua para su potabilización, publicada en el Diario Oficial de la Federación el 22 de noviembre de 2000.

Ciudad de México, a 16 de marzo de 2022.- El Comisionado Federal para la Protección contra Riesgos Sanitarios y Presidente del Comité Consultivo Nacional de Normalización de Regulación y Fomento Sanitario, Alejandro Ernesto Svarch Pérez.- Rúbrica.

APÉNDICE A

NORMATIVO

Parámetros que conforman los grupos de compuestos orgánicos sintéticos

Tabla A.1 Límites permisibles de compuestos orgánicos halogenados adsorbibles fijos

Parámetros

Límite permisible

Unidades

COMPUESTOS ORGANICOS SEMIVOLATILES CLORADOS

Hexaclorobutadieno

0.60

µg/L

Pentaclorofenol

9.0

µg/L

2,4,6 Triclorofenol

200

µg/L

Epiclorohidrina

0.40

µg/L

PLAGUICIDAS CLORADOS

Alacloro

20

µg/L

Combinación Aldrin + Dieldrin

0.03

µg/L

Atrazina

100

µg/L

Clordano (total de isómeros)

0.20

µg/L

Cianazina

0.60

µg/L

DDT y metabolitos

1.0

µg/L

Endrin

0.60

µg/L

Lindano

2.0

µg/L

Metolacloro

10

µg/L

Metoxicloro

20

µg/L

Pendimetalina

20

µg/L

Terbutilazina

7.0

µg/L

Trifluralina

20

µg/L

HERBICIDAS CLORADOS

2,4-D

30

µg/L

2,4,5-T

9.0

µg/L

2,4,5-TP

9.0

µg/L

2,4-DB

90

µg/L

Diclorprop

100

µg/L

Mecoprop

10

µg/L

PLAGUICIDAS CLORADOS DERIVADOS DE UREA

Clorotoluron

30

µg/L

Tabla A.2 Límites permisibles de compuestos orgánicos no halogenados

Parámetros

Límite permisible

Unidades

CARBAMATOS Y COMPUESTOS ORGÁNICOS SEMIVOLÁTILES

Aldicarb

10

µg/L

Carbofurán

7.0

µg/L

Ácido edético

600

µg/L

Ácido nitrilotriacético

200

µg/L

Acrilamida

0.50

µg/L

HIDROCARBUROS POLIAROMÁTICOS

Benzo(a)pireno

0.70

µg/L

PLAGUICIDAS FOSFORADOS

Clorpirifos

30

µg/L

Dimetoato

6.0

µg/L

Molinato

6.0

µg/L

Simazina

2.0

µg/L

COMPUESTOS ORGÁNICOS SEMIVOLÁTILES NO CLORADOS

Di-(2-Etilhexil) ftalato

8.0

µg/L

PLAGUICIDAS NO CLORADOS DERIVADOS DE UREA

Isoproturon

9.0

µg/L


Tabla A.3 Límites permisibles de compuestos orgánicos halogenados adsorbibles purgables

Parámetros

Límite permisible

Unidades

COMPUESTOS ORGÁNICOS HALOGENADOS VOLÁTILES

1,2-Diclorobenceno

1000

µg/L

1,2-Dicloroeteno (cis + trans)

50

µg/L

1,2-Dicloropropano

40

µg/L

1,2-Dicloroetano

30

µg/L

1,3-Dicloropropeno (cis + trans)

20

µg/L

1,4-Diclorobenceno

300

µg/L

Cloruro de Vinilo

0.30

µg/L

Diclorometano

20

µg/L

Tetracloroeteno

40

µg/L

Tetracloruro de carbono

4.0

µg/L

Tricloroeteno

20

µg/L

1,2-dibromoetano

0.40

µg/L

1,2-dibromo-3-cloropropano

1.0

µg/L

APÉNDICE B NORMATIVO

Métodos de prueba

B.1 MÉTODOS PARA LA DETERMINACIÓN DE MICROCISTINA EN AGUA PARA USO Y CONSUMO HUMANO

Para el cumplimiento de esta Norma, se deberá utilizar el método de ELISA cualitativo de respuesta rápida (screening) para la determinación de microcistinas y nodularinas totales, contenido en el punto B.1.1 de este Apéndice).

En caso de que dicho método resulte en la ausencia de microcistinas o nodularinas totales no será necesario llevar a cabo ningún método confirmatorio adicional.

En caso de que dicho método resulte en la presencia de microcistinas o nodularinas totales deberá de llevarse a cabo alguno de los dos métodos cuantitativos confirmatorios siguientes:

       Método para la determinación de microcistinas y nodularinas en agua de uso y consumo humano por extracción en fase sólida y cromatografía líquida/espectrometría de masas en tándem (LC/MS/MS), contenido en el punto B.1.2 de este Apéndice.

       Método para la determinación de microcistina mediante SPE y la cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC) con detección (UV) ultravioleta, contenido en el punto B.1.3 de este Apéndice.

Sin embargo, para la determinación de microcistina-LR podrá optarse por determinar directamente dicha sustancia a través de los métodos confirmatorios cuantitativos descritos en los puntos B.1.2 y B.1.3 de este Apéndice, sin llevar a cabo el método de screening ELISA (B.1.1, de este Apéndice).

B.1.1 MÉTODO PARA LA DETERMINACIÓN DE MICROCISTINAS Y NODULARINAS TOTALES  EN AGUA DE USO Y CONSUMO HUMANO MEDIANTE EL ENSAYO INMUNOENZIMÁTICO ADDA

B.1.1.1 Definiciones y términos

Agua grado reactivo, al agua purificada que no contiene ninguna cantidad cuantificable de microcistinas, nodularinas o compuestos que interfieran en o por encima de la media del MRL.

Blanco de reactivo de laboratorio (LRB), a la alícuota de agua grado reactivo lisada y filtrada para coincidir en el mismo procedimiento analítico utilizado para las muestras de campo. El LRB se utiliza para determinar si se introducen microcistinas u otras interferencias por medio de los recipientes de la muestra, los equipos de procesamiento de muestras o los reactivos utilizados en el ensayo.

Blanco fortificado de laboratorio (LFB), a la alícuota de agua grado reactivo a la que se añade una cantidad conocida de MC-LR. El LFB es lisado y filtrado para coincidir en el mismo procedimiento analítico utilizado para las muestras de campo. El LFB se utiliza durante la IDC para verificar el rendimiento del método con precisión y exactitud. El LFB también es un elemento de control de calidad requerido con cada lote de análisis. Los resultados del LFB verifican el rendimiento del método en ausencia de matriz de muestra.

Concentración más baja del nivel mínimo reportado (LCMRL), al punto de concentración más baja, tal que la probabilidad de recobro se encuentre entre el 50 y 150% con al menos 99% de confianza.

Curva de calibración, a los puntos de calibración se modelan utilizando una función logística de cuatro parámetros, relacionando la concentración (eje x) con la absorbancia medida en los pozos (eje y). A continuación se presenta un ejemplo de curva de calibración generada durante el desarrollo del método. Es importante observar la relación inversa entre la concentración y la respuesta (absorbancia).

Lisado, a la mezcla de sustancias formada por el material liberado cuando las células son fragmentadas por enzimas, químicos inorgánicos o medios físicos.

Fig. B.1.1-1. Curva de calibración de ELISA con cálculo de la EC50.  El eje x se encuentra en escala logarítmica.

El estándar de calibración cero proporciona la absorbancia más alta y el estándar de calibración más alto proporciona la absorbancia más baja. De igual manera, es importante observar también que la pendiente, o sensibilidad, de la respuesta ELISA es mayor en el centro de la curva y tiende a una pendiente de cero a concentraciones extremadamente bajas y altas. Para una explicación más detallada del modelo de calibración de cuatro parámetros pueden revisarse referencias específicas como Maciel (1985) y Sasaki (2016).

Ecuación logística de cuatro parámetros:

En donde:

       y        absorbancia

       x        concentración

       a        absorbancia en la meseta inferior

       b        pendiente en el punto de inflexión

       c        concentración en el punto de inflexión = EC50

       d        absorbancia en la meseta superior

Los coeficientes a, b, c y d, son calculados por el software de reducción de datos usando análisis de regresión.

Duplicado de la matriz de muestra fortificada en laboratorio (LFSMD), a la segunda alícuota de la muestra de campo utilizada para preparar el LFSM que se fortifica y ensaya en el mismo lote de análisis que el LFSM. El LFSMD se utiliza para verificar la precisión del método en las matrices de agua de uso y consumo humano.

EC50, a la concentración de microcistina que produce una absorbancia media entre la meseta inferior de la curva de calibración (coeficiente a) y la meseta superior (coeficiente d). La EC50 es la concentración en el punto de inflexión (Fig. B.1.1-1 de este Apéndice B) y está en el centro del intervalo de medición más confiable (es decir, la mayor pendiente) de la ELISA.

Para cada curva de calibración, la EC50 es igual al coeficiente c, del ajuste logístico de cuatro parámetros. El EC50 se encuentra en el informe de calibración generado por el lector de placas.

Debido a que la EC50 está en el centro del intervalo de medición más confiable, la guía para fortificar muestras de control de calidad se basa en este valor. Para este método, las muestras de control de calidad que requieren ser fortificadas con MC-LR deben tener concentraciones cerca de la EC50. Estas muestras de control de calidad incluyen blancos fortificados de laboratorio y matriz de muestras fortificadas de laboratorio.

Estándar de calibración, soluciones de MC-LR suministradas en el kit de la prueba de ELISA o preparadas en el laboratorio, que son apropiadas para el rango de medición del kit de ELISA.

Solución estándar de dilución primaria (PDS), solución de MC-LR en metanol (o el indicado por el fabricante) preparado a partir de la solución estándar MC-LR. Las soluciones de PDS se utilizan para fortificar muestras de control de calidad (LFB, LFSM y LFSMD).

Estándar de verificación de calibración de bajo alcance (LOW-CV), estándar de calibración con una concentración igual o inferior al MRL. El propósito de la LOW-CV es confirmar la exactitud de la calibración en concentraciones cercanas al MRL.

Lote de análisis, los estándares, muestras y elementos de control de calidad se ensayan en una sola placa de 96 pozos usando lotes idénticos de reactivos y pozos. Cada placa por definición es un lote de análisis, independientemente del número de pozos incluidos. Las muestras de control de calidad deben analizarse en cada lote de análisis a las frecuencias descritas. Cada lote de análisis incluye los siguientes elementos:

• Estándares de calibración

• Blancos de reactivo de laboratorio

• Estándar de verificación de calibración de bajo alcance

• Blancos fortificados de laboratorio

• Muestras de campo (agua de uso y consumo humano)

• Matriz de muestras fortificadas en laboratorio y duplicados de las matrices de muestras fortificadas  en laboratorio.

Matriz de muestra fortificada en laboratorio (LFSM), alícuota de una muestra de campo a la que se añade una cantidad conocida de MC-LR. El propósito de la LFSM es determinar si la matriz de la muestra contribuye a los resultados analíticos.

Muestra de control de calidad (QCS), solución que contiene MC-LR en una concentración conocida que se obtiene de una fuente diferente de la fuente de los estándares de calibración. El propósito de la QCS es verificar la exactitud de los estándares de calibración primaria.

Nivel mínimo reportado (MRL), concentración mínima que puede ser reportada por un laboratorio como un valor cuantificado para microcistinas y nodularinas totales en una muestra después del análisis. Esta concentración no debe ser inferior a la concentración del estándar de calibración más bajo y debe cumplir con los criterios de control de calidad.

Pozos réplica, dentro del lote de análisis, este método requiere que cada estándar de calibración, muestra de campo y muestra de control de calidad se ensayen en dos pozos. Estos dos pozos se denominan pozos réplica. A cada pozo réplica se asocian dos valores: la absorbancia medida por el lector de placas y la concentración calculada a partir de esta absorbancia.

Para cada conjunto de pozos réplica, el coeficiente de variación porcentual (% CV) se calcula a partir de los dos valores de absorbancia. El %CV de los valores de absorbancia para los estándares de calibración debe cumplir con los criterios de control de calidad especificados. El %CV de los valores de absorbancia para todas las muestras de campo y las muestras de control de calidad deben cumplir con los criterios de control de calidad.

Para cada conjunto de pozos replica, se calcula la concentración media de los dos valores de concentración. La concentración media debe usarse para reportar los resultados de la muestra de campo. La media debe utilizarse en todos los cálculos del método y para evaluar los resultados con respecto a los límites de control de calidad.

Solución estándar, estándar concentrado en metanol (o el indicado por el fabricante) que se prepara en el laboratorio a partir de MC-LR purificada o que se adquiere de una fuente comercial con un certificado de análisis.

B.1.1.2 Símbolos y términos abreviados

(4E, 6E)        posición espacial de los alquenos en la molécula

°C        grado Celsius

DPD        N, N-dietil-p-fenilendiamina

IDC        demostración inicial de capacidad

LCMRL        concentración más baja del nivel mínimo reportado

LFB        blanco fortificado de laboratorio

LFSM        matriz de muestra fortificada en laboratorio

LFSMD        duplicado de la matriz de muestra fortificada en laboratorio

LOW-CV        estándar de verificación de calibración de bajo alcance

LRB        blanco de reactivo de laboratorio

MC        microcistina

MC/NOD        relación microcistina entre nodularina

MC-LR        microcistina-LR

mm        milímetro

MRL        nivel mínimo reportado

µg/ml        microgramo/mililitro

µm        micrómetro

µL        microlitro

nm        nanómetro

NOD        nodularina

NOD-R        Nodularina-R

PDS        solución estándar de dilución primaria

PIR        intervalo de predicción de resultados

PTFE        politetrafluoroetileno

QCS        muestra de control de calidad

RPD        diferencia porcentual relativa

r2        cuadrado del coeficiente de correlación

%        por ciento

%CV        coeficiente de variación porcentual

%R        porcentaje promedio de recuperación

%RSD        porcentaje de desviación estándar relativa

       menor o igual a

>        mayor a

       mayor o igual a

B.1.1.3 Principio

El método descrito es un procedimiento mediante ensayo inmunoenzimático (ELISA). Este método se basa en un sistema de placas de microtitulación de 96 pozos, en estos pozos, las microcistinas y nodularinas presentes en la muestra y proteína análoga de microcistina inmovilizada en los pozos, compiten por los sitios de unión de un anticuerpo de detección primaria en solución.

Después de una etapa de lavado, se añade un conjugado enzimático a los pozos y se une al anticuerpo primario en una relación inversa con la concentración original de microcistinas y nodularinas en la muestra. Después de un segundo paso de lavado, se añade substrato de tetrametilbenzidina para desarrollar color a través de una reacción enzimática.

Tras un período establecido, se añade una solución ácida a cada pozo para detener la generación de color. Finalmente, la absorbancia de cada pozo se mide utilizando un lector de placas y la concentración de microcistinas y nodularinas se calcula utilizando una curva de calibración logística de cuatro parámetros.

B.1.1.4 Alcance y aplicación

El método descrito es un procedimiento para la determinación de microcistinas (MC) y nodularinas (NOD) "totales" en agua de uso y consumo humano (antes y después del tratamiento). El término "microcistinas y nodularinas totales" se define como la suma de todos los congéneres independientes, tanto de microcistinas intracelulares y extracelulares, como de nodularinas que es medible en una muestra. Este método determina la concentración total basada en la detección de una característica común a los congéneres (variantes estructurales) de microcistina y nodularina, específicamente la cadena lateral de aminoácidos Adda: Ácido (4E, 6E)-3-amino-9-metoxi-2,6,8-trimetil-10-fenildeca-4,6-dienoico (Fischer et al., 2001). Con la finalidad de asegurar la comparabilidad entre los laboratorios, el ELISA se calibra contra el congénere Microcistina-LR (MC-LR) (CASRN 101043-37-2).

B.1.1.5 Equipos y materiales

Las referencias a marcas específicas y números de catálogo se incluyen sólo como ejemplos y no implican aprobación de los productos. Dicha referencia no excluye el uso de otros proveedores o fabricantes. Las referencias específicas pretenden representar especificaciones adecuadas para los artículos.

Contenedores de muestras. Botellas de vidrio ámbar con tapas con rosca de politetrafluoroetileno (PTFE). Se recomienda el uso de contenedores de muestras. Si se reutilizan contenedores de muestra deben de llevarse a cabo buenas prácticas de laboratorio para la limpieza. No deben utilizarse botellas tratadas a alta temperatura en un horno de mufla (400 °C y superiores) como procedimiento de limpieza. Los estudios existentes indican una tendencia a que las microcistinas y las nodularinas se adsorben en la superficie de la cristalería limpiada repetidamente por calentamiento en un horno de mufla.

Cubiertas de placas adhesivas. Película adhesiva transparente para sellar los pozos durante las etapas de incubación del ensayo (VWR no. 60941-120).

Filtros de jeringa para filtrado de muestras después de la lisis. Pueden utilizarse filtros de fibra de vidrio de 25mm, con un tamaño de poro de 1.2µm y carcasa de polipropileno (Environmental Express no. SF012G) o filtros de fibra de vidrio de 25 mm, con un tamaño de poro de 0.45µm y carcasa de polipropileno (GE Healthcare Life Sciences/Whatman no. 6894-2504).

Jeringas para filtrado de muestras después de la lisis. Pueden utilizarse jeringas de cristal con cerrado Luer-lock que no permita el paso de aire, de 5mL de capacidad (Hamilton Co. no. 1005TLL) o jeringas de plástico con cerrado Luer-lock que no permita el paso de aire, con una capacidad de 3 mL y cilindros de polietileno y émbolos de polipropileno (Thermo Fisher Scientific, Inc. no. S7515-3).

Kit de prueba de ELISA Adda. Ensayo competitivo indirecto basado en la detección del epítopo Adda (Abraxis no. 520011OH o equivalente). Pueden usarse sistemas automatizados para procesar la placa de 96 pozos.

Lector de Placas. Lector de placas de microtitulación y software asociado con la capacidad de determinar la absorbancia a 450 nm y construir una curva de calibración utilizando una función logística de cuatro parámetros.

Pipeta de repetición. Pipeta electrónica de repetición HandyStep con puntas desechables de 5 ml (Wertheim, Alemania). Se recomienda una pipeta electrónica de repetición para la adición del anticuerpo a los pozos, el conjugado enzimático, el sustrato y la solución de paro.

Pipeta multicanal. Pipeta de ocho canales con 250µL de capacidad por canal y puntas de pipeta de polipropileno. Se recomienda para la adición a los pozos de la solución de lavado.

Pipeta para carga de pozos. Pipetas manuales ajustables o de volumen fijo con capacidad de 50µL y puntas de pipeta recomendadas por el fabricante. Se recomienda para la adición a los pozos de los estándares, las muestras de campo y las muestras de control de calidad.

Recipiente para la solución de lavado. Recipiente de plástico diseñado para pipetas multicanal  (VWR no. 21007-970). Se recomienda que tenga una capacidad de 55 mL.

Viales de cuatro mililitros. Pueden utilizarse viales de vidrio de borosilicato, con tapas que contengan empaques de PTFE. Se recomiendan para colocar y almacenar el filtrado de la muestra después de la lisis.

Viales de quince a cuarenta mililitros. Los viales utilizados deben de ser de vidrio de borosilicato, transparentes o ámbar, con tapas con empaques de PTFE. Se recomiendan viales con capacidad en este rango para el procedimiento de lisis. No deben utilizarse botellas tratadas en un horno de mufla a alta temperatura como procedimiento de limpieza.

B.1.1.6 Reactivos y soluciones

Agente reductor de cloro residual. El tiosulfato de sodio (no. CAS 7772-98-7) se utiliza para reducir el cloro residual en las muestras de agua potable en el momento de la recolección.

Estándares de calibración. Se recomienda el uso de los estándares de calibración suministrados en los kits ELISA. Se permiten los estándares de calibración preparados en el laboratorio. Los laboratorios deben utilizar prácticas apropiadas de control de calidad para determinar cuándo deben reemplazarse los estándares.

Solvente regular y para PDS. El metanol (no. CAS 67-56-1) o el indicado por el fabricante; se usa para reconstituir MC-LR si este material se adquiere como un sólido, y para diluir el material de MC-LR para preparar soluciones PDS.

Soluciones y PDS de MC-LR. Se recomienda obtener la MC-LR (no. CAS 101043-37-2) como una solución con una concentración de al menos 10 µg/mL o como el material puro. En caso de que sea como material puro, este debe de reconstituirse en metanol para obtener una solución con una concentración de al menos 10 µg/mL. Esta solución de MC-LR debe diluirse con metanol para preparar soluciones PDS. Las concentraciones de MC-LR para soluciones PDS deben de ser seleccionadas de tal manera que al menos se utilicen 5µL para fortificar muestras de control de calidad o para preparar estándares de calibración. Más de una concentración de solución PDS puede ser necesaria para cumplir con este requisito.

B.1.1.7 Procedimiento

B.1.1.7.1 Recolección, conservación y almacenamiento de muestras

Antes del salir a colectar las muestras, debe agregarse tiosulfato de sodio a cada botella de muestra; para lo cual deberá colocar en el material de muestreo, previo a la esterilización 0.1 mL de solución de tiosulfato de sodio al 10% para neutralizar 120 mL de la muestra o bien 0.4 mL para 480 mL. El tiosulfato de sodio no debe de diluirse en agua al preparar las botellas para las muestras. El agente reductor debe añadirse a la botella vacía en forma sólida. En el campo, abra el grifo y deje que el sistema se descargue durante aproximadamente 5 minutos. Llenar cada botella, teniendo cuidado de no eliminar el tiosulfato de sodio, e invertir varias veces para mezclar la muestra con el agente reductor.

Colecte suficiente muestra para cumplir con los requisitos de este método. Para el tamaño de la muestra debe de considerarse un volumen suficiente para preparar las muestras de control de calidad y el volumen apropiado para el almacenamiento congelado.

No debe utilizarse ácido ascórbico para reducir el cloro en las muestras de agua de uso y consumo humano. Durante los estudios para evaluar la estabilidad de las microcistinas durante el transporte y el almacenamiento, se ha descrito que éstas se degradan en presencia de ácido ascórbico.

La adición de tiosulfato de sodio no es necesaria para agua de uso y consumo humano antes del tratamiento (muestras colectadas antes de la entrada al sistema de tratamiento), sin embargo, puede añadirse si el laboratorio elige preparar un solo tipo de contenedor de muestra.

Las muestras deben ser refrigeradas durante el envío y no deben exceder los 10 °C durante las primeras 48 horas después de la recolección.

Se debe confirmar que las muestras están por debajo o igual a 10 °C cuando se reciben en el laboratorio. Una temperatura superior a 10 °C es aceptable en aquellos casos en los que el tiempo de traslado es corto y las muestras no tienen tiempo suficiente para alcanzar la temperatura mencionada. En este caso, deben revisarse las bolsas de hielo en las hieleras de transporte. Si éstas aún permanecen congeladas, las muestras pueden considerarse válidas. Las muestras deben de ser congeladas al llegar al laboratorio.

Para muestras de agua de uso y consumo humano que ha pasado a través de un sistema de tratamiento, debe analizarse una muestra de cada hielera de transporte utilizando ensayos comunes para determinar el cloro libre residual, por ejemplo, la técnica colorimétrica N, N-dietil-p-fenilendiamina (DPD). La concentración total de cloro debe ser menor que el límite de detección del ensayo. Se puede recoger una muestra duplicada para llevar a cabo el ensayo de cloro libre residual.

Para el almacenamiento en congelación, deben utilizarse botellas de vidrio de borosilicato, claras o ámbar, con tapas con empaques de PTFE. Seleccione la capacidad de la botella y el volumen de la muestra para evitar la ruptura de las botellas durante la congelación. Planee con anticipación para contar con suficiente volumen para preparar muestras de control de calidad como se requiere en este método.

Las muestras deben de ser analizadas lo antes posible. Las muestras que se colectan y almacenan deben analizarse dentro de los 14 días posteriores a la recolección. Este periodo de 14 días se estableció como un tiempo de retención seguro basado en la evidencia empírica: durante el desarrollo del método, se observó la degradación de microcistinas en dos matrices de agua potable después de tres semanas de almacenamiento en congelación.

Las muestras pueden filtrarse y analizarse en cualquier momento después de lisis, dentro de los 14 días posteriores a la recolección. Si no se analizan inmediatamente, las muestras lisadas pueden almacenarse mediante congelación en viales de vidrio con tapas con empaques de PTFE, por ejemplo, 1 ml de muestra lisada y filtrada contenida en un vial de 4 ml.

B.1.1.7.2 Procedimiento analítico

Este apartado describe el procedimiento para preparar las muestras y procesar la placa de microtitulación para realizar el ELISA. Fortifique las muestras QC antes de la etapa de lisis (LFB, LFSM y LFSMD). Si las muestras se congelaron, es aceptable fortificar después de este primer ciclo de lisis.

Mezclar completamente e inmediatamente transferir 5 a 10 mL de cada muestra de campo en un vial de 40 mL para comenzar tres ciclos de congelación-descongelación. Si la muestra se congeló previamente, sólo se necesitan dos ciclos de congelación-descongelación. Pueden utilizarse viales más pequeños, pero reduzca el volumen de la muestra a menos del 25% de la capacidad del vial. Asegúrese de que las muestras estén completamente congeladas y completamente descongeladas durante cada ciclo. Descongelar las muestras a aproximadamente 35 °C en un baño de agua y mezclar después de cada ciclo.

Filtrar 1 a 2 mL de cada muestra lisada en un vial de 4 mL usando un filtro de jeringa de fibra de vidrio.

Para realizar el ELISA siga las instrucciones del fabricante para agregar muestras y reactivos a la placa. Llene dos pozos con cada estándar de calibración, muestra de campo y muestra de control de calidad. Al construir el lote de análisis debe asegurarse de que se incluyen todos los elementos de control de calidad requeridos. Las muestras de agua de uso y consumo humano pueden ser procesadas en el mismo lote  de análisis.

Para el desarrollo del color, si se procesan las placas manualmente, utilice una técnica que asegure que cada pozo se incube con sustrato exactamente durante el mismo período. Para lograr esto, añadir solución de paro en la misma secuencia y al mismo ritmo que la adición de sustrato.

Medir el color leyendo la absorbancia a 450 nanómetros usando un lector de placas de microtitulación.

B.1.1.7.3 Análisis de datos y cálculos

Se debe utilizar un ajuste de curva logística de cuatro parámetros. No se permiten otros modelos de ajuste de curvas. Calcular la concentración de la muestra para cada pozo utilizando la calibración multipunto. Para cada campo y muestra QC, debe promediarse los dos valores de concentración de cada pozo. Utilice esta promedio para reportar los resultados de las muestras y para evaluar los resultados del control de calidad frente a los límites de aceptación. Reporte solamente los valores que están entre el MRL y el estándar de calibración más alto. Los resultados finales se redondearán a dos cifras significativas.

Si un resultado excede el rango de la curva de calibración, diluya la muestra con agua grado reactivo. Basándose en la concentración estimada, seleccione un factor de dilución que resulte en una concentración de muestra diluida cerca de la EC50 de la curva de calibración. La concentración en la muestra diluida debe situarse entre el MRL y el estándar de calibración más alto. Analizar la muestra diluida en un lote de análisis posterior. Incorporar el factor de dilución en los cálculos de la concentración final. Informe el factor de dilución con el resultado de la muestra.

B.1.1.7.4 Informe de prueba

Reportar microcistinas y nodularinas totales como Ausente o Presente.

En caso de que el resultado sea ausencia de microcistinas o nodularinas totales no será necesario llevar a cabo ningún método confirmatorio adicional.

En caso de que el resultado sea presencia de microcistinas o nodularinas totales deberá de llevarse a cabo alguno de los dos métodos cuantitativos confirmatorios contenidos en los puntos B.1.2 y B.1.3 de este Apéndice.

B.1.1.8 Control de calidad, calibración e interferencias

B.1.1.8.1 Control de calidad (QC)

Los requisitos de control de calidad incluyen los elementos IDC y QC asociados con cada lote de análisis.

Este apartado describe cada parámetro QC, su frecuencia requerida y los criterios de desempeño que deben cumplirse para satisfacer los objetivos de calidad de datos. Estos requisitos de QC se consideran como lo mínimo aceptable en un protocolo de calidad. Sin embargo, los laboratorios pueden establecer prácticas adicionales de control de calidad para satisfacer sus necesidades específicas.

El IDC debe llevarse a cabo antes de analizar las muestras de campo. El IDC incluye cuatro determinaciones: demostración de exactitud y precisión, demostración de la presencia de interferencias en el sistema, confirmación de MRL y una verificación de segunda fuente de los estándares de calibración (muestra de control de calidad). Los requisitos de IDC se describen en la Tabla B.1.1-1 de este Apéndice.

Tabla B.1.1-1. Requisitos de control de calidad de la demostración inicial de capacidad (IDC)

Requisito

Especificación

Criterio de aceptación

Demostración de exactitud y precisión

Lisar y analizar 7 réplicas de blancos fortificados de laboratorio (LFB) a 0.50µg/L

Porcentaje de desviación estándar relativa 15%. Porcentaje promedio de recuperación 70% y 130%

Demostración de la presencia de interferencias en el sistema

Lisar y analizar 5 blancos de reactivo de laboratorio (LRB) distribuidos a lo largo de la placa.

La concentración de MC debe ser menor que la mitad del Nivel mínimo reportado (MRL) en cada LRB

Confirmación de MRL

Fortificar y analizar 7 LFB replicados a la concentración de MRL propuesta. Confirmar que el límite superior e inferior del intervalo de predicción de resultados (PIR) cumpla con los criterios de recuperación.

Límite superior PIR 150%

Límite interior PIR 50%

Verificación de segunda fuente de los estándares de calibración (muestra de control de calidad).

Prepare un QCS cerca de la EC50 con MC-LR de una fuente independiente de los estándares de calibración.

Porcentaje de recuperación 70% y 130% del valor real

Al realizar el IDC, el analista debe cumplir con los requisitos de calibración especificados en el apartado correspondiente. El estándar de calibración más bajo utilizado para establecer la calibración inicial debe ser igual o inferior a la concentración que representa el MRL. Las cuatro determinaciones necesarias para completar el IDC pueden incluirse en un lote de análisis único, es decir, procesarse en una única placa de ELISA.

Para la demostración de exactitud y precisión, deben prepararse siete LFB repetidos fortificando cada uno con 0.50µg/L de MC-LR. Se debe añadir tiosulfato de sodio. Lisar, filtrar y analizar los LFB en un solo lote de análisis. Para este lote de análisis, se deben de incluir los LRB para cumplir con el requisito QC de LRB. También se requiere un LOW-CV. El porcentaje de desviación estándar relativa (%RSD) para MC-LR en las siete repeticiones de LFB debe ser menor o igual a 15%. La recuperación media de las siete repeticiones debe ser mayor o igual que 70% e inferior o igual a 130%.

Para la demostración de la presencia de interferencias en el sistema, en el mismo lote de análisis llevado a cabo para la exactitud y precisión en la IDC, lisar, filtrar y analizar cinco LRB. Los LRB deben contener tiosulfato de sodio. Los LRB deben distribuirse a lo largo de toda la placa. El resultado obtenido para cada LRB debe ser inferior a la media del MRL.

Para la confirmación del MRL, se debe establecer una concentración objetivo para el MRL en función del uso destinado del método. Confirme el MRL siguiendo el procedimiento descrito a continuación:

Preparar y analizar muestras de MRL - Fortifique siete LFB replicados con MC-LR en, o por debajo, la concentración de MRL propuesta. Los LFB deben contener tiosulfato de sodio como se especifica. Lisar, filtrar, y analizar las muestras en un lote de análisis único. El lote de análisis debe incluir dos LRB y un LOW-CV.

Calcular las estadísticas del MRL - Calcular la media y la desviación estándar de las siete réplicas. Determinar el intervalo medio para el intervalo de predicción de resultados (HRPIR) usando la siguiente ecuación:

En donde:

s        desviación estándar

3.963        valor constante para 7 réplicas

Calcular los límites superiores e inferiores para el intervalo de predicción de resultados (PIR=promedio±HRPIR) como se muestra a continuación:

Estas ecuaciones se definen sólo para siete muestras repetidas.

Para los criterios de aceptación de MRL, se confirma el MRL si el límite superior del PIR es menor o igual a 150% y el límite inferior del PIR es mayor o igual al 50%. Si estos criterios no se cumplen, el MRL puede establecerse demasiado bajo y la confirmación debe repetirse, o se debe establecer y confirmar el MRL a una concentración más alta.

Para las QCS, debe analizarse una QCS de nivel medio, para confirmar la exactitud de los estándares de calibración primaria.

Los elementos QC que deben incluirse en cada lote de análisis. Los requisitos de lotes de análisis de QC se resumen en la Tabla B.1.1-2, de este Apéndice.

Tabla B.1.1-2. Requisitos del lote de análisis de QC

Requisito

Especificación y frecuencia

Criterio de aceptación

Calibración de ELISA

Use los niveles y concentraciones recomendados por el kit. Dos pozos réplica por estándar.

%CV de absorbancia 10%; 15% permitido para un par.

r2 0.98

Pozos réplica

Muestra de campo y de control de calidad en dos pozos.

Muestra no valida si el %CV de los valores de absorbancia >15%

Blanco de reactivos de laboratorio (LRB)

Lisar un LRB por lote de análisis. Analizar en duplicado en lados opuestos de la placa.

La concentración de MC/NOD debe ser menor que la mitad del MRL en cada LRB.

Estándar de verificación de calibración de bajo alcance (LOW-CV)

Estándar de calibración en la concentración de MRL o por debajo de la misma. Se debe de tener uno por cada lote de análisis.

Porcentaje de recuperación 50% y 150% del valor verdadero.

Blanco fortificado de laboratorio (LFB)

Agua grado reactivo fortificada cerca de la EC50 Lisar y analizar dos por lote de análisis.

Porcentaje de recuperación para cada LFM 60% y 140% del valor verdadero.

Matriz de muestra fortificada en laboratorio (LFSM) y duplicado de LFSM (LFSMD)

Fortifique cerca de la EC50 y al doble de la concentración nativa. Un conjunto en lotes de análisis que contienen agua potable de uso y consumo humano y dos si son 20 o más muestras de campo. Un conjunto en Lotes de análisis que contienen agua colectada antes de la entrada al sistema de tratamiento y dos si son 20 o más muestras de campo.

Porcentaje promedio de recuperación del par de LFSM y LFSMD 60% y 140%. Diferencia porcentual relativa (RPD) 40%. Calificar los resultados de muestras que no cumplen estos límites como "matriz sospechosa".

Muestra de control de calidad (QCS)

Analizar 1 QCS para cada nuevo lote de estándares de calibración. Preparar el QCS cerca de la EC50 con MC-LR de una fuente independiente de los estándares de calibración.

Porcentaje de recuperación 70% y 130% del valor verdadero.


Todas las muestras de campo y de QC deben añadirse a por lo menos dos pozos (pozos réplica). El %CV de los valores de absorbancia determinados para los pozos réplica debe ser menor o igual a 15%. Calcular  el % CV como sigue:

Si el %CV excede 15% de la muestra de campo o la muestra de QC (LOW-CV, LRB, LFB, LFSM y LFSMD), entonces la muestra no se considera válida. Note que los pozos réplica de los estándares de calibración deben cumplir un conjunto de criterios diferentes para %CV.

Para cada lote de análisis, preparar, lisar y filtrar un Blanco de reactivo de laboratorio (LRB). El LRB debe contener tiosulfato de sodio si muestras de agua potable se incluyen en el lote de análisis. Analizar el LRB por duplicado colocando un par de pozos réplica en lados opuestos de la placa (cuatro pozos totales). La concentración total de microcistina y nodularina en cada LRB debe ser inferior a la mitad del MRL. Si la concentración es igual o mayor que este nivel, entonces cualquier muestra con un resultado positivo en el lote de análisis no se considera válida. No se permite restar valores del blanco de los resultados de la muestra.

Con cada lote de análisis, debe analizarse un estándar de verificación de calibración de bajo alcance (LOW-CV). El LOW-CV es un estándar de calibración preparado a una concentración igual o inferior al MRL. Puede utilizarse un estándar de calibración del kit. No debe añadirse tiosulfato de sodio, no lisar y no filtrar el LOW-CV. La concentración analizada en el LOW-CV debe ser mayor o igual al 50% y menor o igual al 150% del valor real. Si el resultado no cumple este criterio, entonces todo el lote de análisis no es válido.

Se requieren al menos dos blancos fortificados de laboratorio (LFB), a una concentración idéntica, con cada lote de análisis. Añadir tiosulfato de sodio si muestras de agua potable se incluyen en el lote de análisis. Fortificar el LFB cerca de la EC50 de la curva de calibración. Lisar y filtrar cada LFB en un vial por separado.

Como criterio de aceptación para el LFB, el porcentaje de recuperación para cada LFB debe ser mayor o igual a 60% y menor o igual a 140% del valor real. Si el LFB no cumple este criterio, entonces todo el lote de análisis no se considera válido.

Se requiere un conjunto de matriz de muestra fortificada en laboratorio (LFSM) y duplicado de la matriz de muestra fortificada en laboratorio (LFSMD) con cada lote de análisis en una muestra de agua de uso y consumo humano, sin embargo, si más de 20 muestras de agua están presentes en el lote de análisis, entonces se requieren dos conjuntos. De la misma manera, se requiere un conjunto LFSM y LFSMD con cada lote de análisis en una muestra de agua antes de la entrada al sistema de tratamiento, sin embargo, si hay más de 20 muestras de agua en el lote de análisis, entonces se requieren dos conjuntos. La concentración nativa en la muestra debe determinarse en una muestra de campo de manera independiente. En la rutina de trabajo, distribuya los LFSM entre las diversas fuentes de agua de uso y consumo humano (antes y después del tratamiento).

Se requieren tres alícuotas separadas de una muestra de campo para determinar la concentración nativa y para preparar el LFSM y el LFSMD. Preparar el LFSM y LFSMD fortificando dos alícuotas de la misma muestra de campo con una cantidad apropiada de MC-LR. Si está congelado, descongelar las muestras. Mezclar bien para homogeneizar la muestra antes de distribuir en los tres viales. Elija una concentración tal que el resultado de la microcistina total y la nodularina se encuentre cerca de la EC50 de la curva de calibración y fortifique al menos el doble de la concentración nativa, si se conoce. Lisar y filtrar las muestras, o si las muestras fueron congeladas, completar dos ciclos más de lisis.

Si no se conoce la concentración en este tipo de muestras de agua, seleccione aleatoriamente las muestras y fortifique con aproximadamente 1.0µg/L de MC-LR. Si la concentración inicial en los LFSM seleccionados al azar es alta, el resultado de la muestra fortificada puede caer fuera del intervalo de la calibración de ELISA, o fallar en cumplir el requisito de fortificar a una concentración al menos dos veces del valor nativo. En estos casos, los resultados del control de calidad se consideran inutilizables y pueden descartarse. Sin embargo, el laboratorio debe intentar recolectar datos válidos de LFSM con el tiempo para este tipo de muestras de agua.

Cálculo del porcentaje promedio de recuperación - Calcular el porcentaje promedio de recuperación (%R) para cada conjunto de LFSM y LFSMD utilizando la siguiente ecuación:

En donde:

A        concentración determinada promedio del LFSM y LFSMD

B        concentración determinada en la muestra sin fortificar

C        concentración fortificada

Para obtener resultados significativos del porcentaje de recuperación, se debe corregir el valor promedio del LFSM y LFSMD para la concentración nativa en la muestra no fortificada, incluso si el valor nativo es menor que el MRL.

El porcentaje promedio de recuperación para cada conjunto LFSM y LFSMD debe ser mayor o igual al 60% y menor o igual al 140% del valor real. Si el porcentaje de recuperación queda fuera de este intervalo, y el rendimiento del laboratorio está en control de los LFB dentro del mismo lote de análisis, la recuperación puede tener un sesgo de matriz. Calificar el resultado para la muestra de la cual se preparó el LFSM como "matriz sospechosa".

Calcular la diferencia porcentual relativa (RPD) usando la siguiente ecuación:

El RPD para cada conjunto de LFSM y LFSMD debe ser menor o igual al 40%. Si la RPD cae fuera de este intervalo y el rendimiento del laboratorio está en control de los LFB dentro del mismo Lote de Análisis, la precisión puede tener un sesgo de matriz. Calificar el resultado para la muestra de la cual se preparó el LFSMD como "matriz sospechosa".

Una QCS debe ser analizada durante el IDC y posteriormente con cada nuevo lote de estándares de calibración. La MC-LR utilizado para el QCS debe obtenerse de una fuente independiente de la fuente de los estándares de calibración. Preparar el QCS en agua grado reactivo cerca de la EC50. Se puede utilizar un QCS suministrado con el kit ELISA si este criterio es conocido. El porcentaje de recuperación de MC-LR en el QCS debe ser mayor o igual que 70% e inferior o igual a 130%.

B.1.1.8.2 Calibración

Se requiere una calibración con cada lote de análisis. Utilice las concentraciones indicadas en las instrucciones del kit. No agregue niveles de calibración adicionales ni elimine ningún nivel. Los laboratorios pueden preparar estándares de calibración, sin embargo, el número de niveles y concentraciones debe coincidir con los del kit original. Cada estándar de calibración debe agregarse en al menos dos pozos. El estándar de calibración más bajo debe ser igual o inferior a la concentración del MRL.

La curva de calibración se valida evaluando el %CV de los valores de absorbancia para los pozos réplica que representan cada nivel de calibración y el coeficiente de correlación de la curva logística de cuatro parámetros. Calcular el %CV para cada uno de los valores de absorbancia pareados, incluido el estándar "cero". El %CV para cada par debe ser menor o igual al 10%. Sin embargo, se permite que un par exceda del 10% siempre que el %CV sea menor o igual al 15%. El cuadrado del coeficiente de correlación (r2) de la curva de cuatro parámetros debe ser mayor o igual a 0.98.

Si la calibración se encuentra fuera de los límites %CV o el valor r2 es inferior a 0.98, entonces todo el lote de análisis no se considera válido. Analizar las muestras en un lote de análisis posterior. Congelar las muestras filtradas si este lote de análisis no se puede completar el mismo día que el ensayo original. Cada muestra debe estar dentro del tiempo de espera de 14 días para repetir el ensayo.

B.1.1.8.3 Interferencias

La exactitud del procedimiento de ELISA depende de la técnica del analista, la precisión de los volúmenes pipeteados y períodos de incubación uniformes a través de los pozos de cada placa.

La desviación del ensayo se refiere a la imprecisión sistemática en lugar de la imprecisión al azar en las concentraciones determinadas del analito de interés, cuya magnitud depende de la posición de la muestra dentro de la placa. Una posible causa de la desviación del ensayo son ligeras diferencias en los tiempos de incubación a medida que se añaden los reactivos secuencialmente a través de la placa (Davies, Chris. 2005.“Concepts” en “The Immunoassay Handbook”, 3rd ed.; Ed. Wild, David; Elsevier, Ltd. Oxford, UK, p 119 (sección titulada “Assay Drift”)). Para detectar la desviación del ensayo es necesario distribuir a través de la placa muestras de control idénticas. Este método incluye medidas de control de calidad para evaluar la desviación del ensayo. Durante la IDC, los laboratorios deben analizar cinco LRB distribuidos a través de la placa y cada lote de análisis debe incluir dos LRB colocados en lados opuestos de la placa. Debido a que los LRB proporcionan valores de absorbancia cerca de la meseta superior de la curva de calibración, las concentraciones LRB calculadas son sensibles a ligeros cambios en la absorbancia determinada. Si los LRB distribuidos pasan el límite de control de calidad en una media del valor de MRL, entonces la desviación del ensayo de la placa es mínima y puede considerarse bajo control.

Considerando que la microcistina puede ser determinada a la entrada del sistema de tratamiento, en donde el agua puede provenir de una fuente natural, las muestras de agua colectadas en la entrada del sistema de tratamiento, para este método, podrían considerarse como muestras ambientales. En ese sentido es importante observar que durante el desarrollo del método, se ha observado un sesgo positivo de aproximadamente el 30% en muestras de agua ambientales de una sola fuente. Dos aguas ambientales de otras fuentes no causaron sesgo de matriz.

Durante el desarrollo del método, se evaluaron seis fuentes de agua potable para los efectos de la matriz. De estos, tres mostraron sesgo positivo en un rango de 12 a 15%. Tres fuentes no causaron sesgo de matriz.

Este método contempla el análisis de muestras colectadas tanto de agua para uso y consumo humano que ha pasado a través de sistema de tratamiento como de muestras de agua colectadas en la entrada del sistema de tratamiento que provienen de fuentes naturales (muestras ambientales). Con la finalidad de evitar la contaminación cruzada, es importante separar las jeringas de vidrio utilizadas para filtrar el agua de muestras ambientales, que puede contener altos niveles de microcistinas, de las usadas para filtrar el agua potable de uso y consumo humano que ha pasado a través de sistemas de tratamiento. Alternativamente, pueden utilizarse jeringas de plástico desechables. Es importante limpiar adecuadamente los recipientes de las muestras que son vidrio en caso de ser reutilizados. No deben de reutilizarse septos de botellas que contengan muestras de agua ambientales.

Los resultados reportados por este método representan el total de las microcistinas y nodularinas basadas en el método de ELISA Adda calibrado con MC-LR.

B.1.1.9 Seguridad, prevención de contaminación y manejo de residuos

Cada reactivo utilizado en estos procedimientos debe ser tratado como un riesgo potencial para la salud y la exposición a estos materiales debe ser minimizada. Cada laboratorio es responsable de mantener un conocimiento de las regulaciones respecto a la manipulación segura de cualquier producto químico usado en este método. Debe ponerse a disposición de todo el personal involucrado en el análisis las hojas de datos de seguridad de los productos químicos. El riesgo principal cuando se realizan los procedimientos en este método es la exposición a cianotoxinas en las muestras y en los estándares concentrados. Debe de utilizarse equipo de protección personal apropiado para el manejo de muestras y estándares.

Para obtener información sobre la prevención de contaminación aplicable a las operaciones de laboratorio descritas en este método, puede consultar referencias especializadas (p.ej. American Chemical  Society, 2002).

Es necesario que el laboratorio cumpla con las regulaciones vigentes y aplicables en materia de manejo de residuos ante la autoridad correspondiente.

B.1.1.10 Referencias

       American Chemical Society. 2002. “Less is Better, Guide to Minimizing Waste in Laboratories”.

       Davies, Chris. 2005. “Conceptsen “The Immunoassay Handbook”, 3rd ed.; Ed. Wild, David; Elsevier, Ltd. Oxford, UK, p 119 (sección titulada “Assay Drift”).

       Fischer, Werner J. et al. 2001 Congener-Independent Immunoassay for Microcystins and Nodularins. Environ. Sci. Technol.35: 48494856

       Maciel, Robert J. 1985. Standard Curve Fitting in Immunodiagnostics: a Primer. Journal of Clinical Immunoassay. Vol. 8, 98106.

       Ohio EPA Division of Environmental Services. 2015. Ohio EPA Total (Extracellular and Intracellular) Microcystins ADDA by ELISA Analytical Methodology; Method 701.0 Version 2.2 (and previous versions); Ohio EPA: Reynoldsburg, OH.

       Sasaki, Diane and Mitchell, Robert A. 2016. How to Obtain Reproducible Quantitative ELISA Results. Oxford Biomedical Research website.

       Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 23rd. Edition APHA 2017.

       U.S. EPA. 2004. Statistical Protocol for the Determination of the Single-Laboratory Lowest Concentration Minimum Reporting Level (LCMRL) and Validation of Laboratory Performance at or Below the Minimum Reporting Level (MRL); EPA 815-R-05-006; Office of Water: Cincinnati, OH.

       U.S. EPA. 2010. Technical Basis for the Lowest Concentration Minimum Reporting Level (LCMRL) Calculator; EPA 815-R-11-001; Office of Water: Cincinnati, OH.

       U.S. EPA. 2016. Determination of total Microcystints and Nodularins in Drinking Water and Ambient Eater by Adda Enzyme-Linkes Immunosorbent Assay. Method 546.

B.1.2 MÉTODO PARA LA DETERMINACIÓN DE MICROCISTINAS Y NODULARINAS EN AGUA  DE USO Y CONSUMO HUMANO POR EXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA Y CROMATOGRAFÍA LIQUIDA/ESPECTOMETRÍA DE MASAS EN TÁNDEM (LC/MS/MS)

B.1.2.1 Definiciones y términos

Analito surrogado (SUR), al producto químico puro que se asemeja químicamente a los analitos de interés y es extremadamente improbable que se encuentre en cualquier muestra. Este producto químico se añade a una alícuota de muestra en una cantidad o cantidades conocidas antes del procesamiento y se mide con los mismos procedimientos usados para medir los otros analitos. El propósito del SUR es monitorear el desempeño del método con cada muestra.

Blanco de reactivo de laboratorio (LRB), a la alícuota de agua grado reactivo u otra matriz blanco que se trata exactamente como una muestra incluyendo la exposición a toda la cristalería, equipo, disolventes y reactivos, conservantes de muestras y surrogados que se utilizan en el lote de análisis. El LRB se utiliza para determinar si los analitos de interés u otras interferencias están presentes en el entorno del laboratorio, los reactivos o los aparatos.

Blanco fortificado de laboratorio (LFB), al volumen de agua grado reactivo u otra matriz blanco de la que se conocen cantidades del analito y todos los compuestos se añaden en el laboratorio. El LFB se analiza exactamente como una muestra y su propósito es determinar tanto si la metodología está en control como si el laboratorio es capaz de realizar mediciones precisas y exactas.

Concentración más baja del nivel mínimo reportado (LCMRL), a la concentración más baja verdadera para la cual se espera una recuperación futura espera entre 50 y 150% de recuperación, con un 99% de confianza.

Disociación activada por colisiones (CAD), al proceso de convertir la energía de traslación del ion precursor en energía interna por colisiones con moléculas de gas neutro para producir la disociación en los iones del producto.

Duplicados de campo (FD1, FD2), a las dos muestras separadas recolectadas al mismo tiempo y el mismo lugar bajo circunstancias idénticas, y tratadas exactamente igual bajo los mismos procedimientos de campo y laboratorio. El análisis de FD1 y FD2 dan una medida de la precisión asociada con la recolección, conservación y almacenamiento de las muestras, así como de los procedimientos de laboratorio.

duplicado de la matriz de muestra fortificada en laboratorio (LFSMD), al duplicado de la muestra de campo utilizada para preparar la LFSM. El LFSMD es fortificado, extraído y analizados de forma idéntica a la LFSM. El LFSMD se utiliza en lugar del duplicado de campo para evaluar la precisión del método cuando la ocurrencia de los analitos es infrecuente.

Estándar de calibración (CAL), a la solución preparada a partir de la dilución primaria de la solución estándar y/o solución estándar y el surrogado. Las soluciones CAL se utilizan para calibrar la respuesta del instrumento con respecto a la concentración del analito de interés.

Hoja de datos de seguridad del material (MSDS), a la información escrita proporcionada por los vendedores acerca de la toxicidad del producto químico, los riesgos para la salud, las propiedades físicas, riesgo de incendio y reactividad, incluyendo las precauciones de almacenamiento, derrame y manipulación.

Ion precursor, a la molécula protonada del analito ([M + H]+ o [M + 2H]2+). En MS/MS, el ion precursor es masa seleccionada y fragmentada por CAD para producir iones producto distintivos de menor relación m/z.

Ion producto, fragmentos de iones producidos en MS/MS por CAD a partir del ion precursor.

Límite de detección (DL), a la concentración mínima de un analito de interés que puede ser Identificado, medido y reportado con un 99% de confianza de que la concentración del analito es mayor a cero. Esta es una determinación estadística de precisión y no se espera una cuantificación exacta a este nivel.

Lote de análisis, al conjunto de muestras que se analiza en el mismo instrumento durante un período de 24 horas, incluyendo no más de 20 muestras de campo, que comienza y termina con el análisis de los estándares de verificación de calibración continua (CCC) apropiados. Pueden requerirse CCC adicionales dependiendo de la longitud del lote de análisis y/o el número de muestras de campo.

Lote de extracción, al conjunto de hasta 20 muestras de campo (sin incluir las muestras de Control de Calidad, QC) extraídas juntas por la misma persona durante un día de trabajo usando el mismo lote de dispositivos SPE, disolventes, sustitutivos y soluciones para fortificar. Las muestras de QC requeridas incluyen el blanco de reactivo de laboratorio, el blanco fortificado de laboratorio, la matriz de la muestra fortificada de laboratorio y un duplicado de campo o duplicado de matriz de la muestra fortificada de laboratorio.

Matriz de muestra fortificada en laboratorio (LFSM), a la muestra de campo preservada a la que se añaden en el laboratorio cantidades conocidas de los analitos de interés. La LFSM es procesado y analizado exactamente como una muestra y su propósito es determinar si la matriz de la muestra contribuye a los resultados analíticos. Las concentraciones de fondo de los analitos en la matriz de muestra deben ser determinadas en una extracción independiente de la muestra y los valores medidos en la LFSM corregidos para las concentraciones de fondo.

Muestra de control de calidad (QCS), a la solución de analitos de concentraciones conocidas que se obtiene de una fuente externa al laboratorio y diferente del estándar de calibración. La segunda fuente para la solución estándar se utiliza para fortalecer el QCS a una concentración conocida. El QCS se utiliza para comprobar la integridad del estándar de calibración.

Nivel mínimo reportado (MRL), a la concentración mínima que puede ser reportada como un valor cuantificado para un analito en una muestra después del análisis. Esta concentración definida no puede ser inferior a la concentración del estándar de calibración más bajo para ese analito y sólo puede utilizarse si se cumplen los criterios de control de calidad (QC) aceptables para ese estándar.

Solución estándar (SSS), a la solución concentrada que contiene uno o más analitos preparada en el laboratorio utilizando materiales de referencia ensayados o adquiridos de una fuente comercial de buena reputación.

Solución estándar de dilución primaria (PDS), a la solución que contiene los analitos preparados en el laboratorio a partir de soluciones estándar y diluida según sea necesario para preparar soluciones de calibración y otras soluciones de analito necesarias.

Verificación de calibración continua (CCC), al estándar de calibración que contiene los analitos del método y surrogados. El CCC se analiza periódicamente para verificar la exactitud de la calibración existente para esos analitos.

B.1.2.2 Símbolos y términos abreviados

CAD        disociación activada por colisiones

CAL        estándar de calibración

CCC        verificación de calibración continua

C2D5-MC-LR        microcistina LR etilada, d5

DL        límite de detección

ESI        Ionización por electrospray

FD1, FD2        duplicados de campo

LCMRL        concentración más baja del nivel mínimo reportado

LFB        blanco fortificado de laboratorio

LRB        blanco de reactivo de laboratorio

LFSM        Matriz de muestra fortificada en laboratorio

LFSMD        duplicado de la matriz de muestra fortificada en laboratorio

MC-LR        microcistina-LR

mL/min        mililitro/minuto

[M + H]+        Primer estado de protonación del analito

[M + 2H]2+        Segundo estado de protonación del analito

MRL        nivel mínimo reportado

MSDS        hoja de datos de seguridad del material

PDS        solución estándar de dilución primaria

QC        control de calidad

QCS        muestra de control de calidad

RSD        desviación estándar relativa

SPE        extracción en fase sólida

SSS        solución estándar

SUR        analito surrogado

±        más y menos

B.1.2.3 Principio

Una muestra de agua de 500 ml (fortificada con un surrogado) se filtra y se colectan tanto el filtrado como el filtro. El filtro se coloca en una solución de metanol que contiene 20% de agua grado reactivo y se mantiene durante al menos una hora a -20 ºC para liberar las toxinas intracelulares de las célula de cianobacterias capturadas en el filtro. El líquido se extrae del filtro y es añadido al filtrado acuoso de 500mL. La muestra de 500 ml (más la solución de toxina intracelular) es pasa a través de un cartucho de SPE para extraer los analitos de interés y el surrogado. Los analitos se eluyen de la fase sólida con una pequeña cantidad de metanol que contiene un 10% de agua grado reactivo. El extracto es concentrado a sequedad por evaporación con nitrógeno en un baño de agua caliente y luego se ajusta a un volumen de 1 ml con metanol que contiene un 10% de agua grado reactivo. Se hace una inyección de 10 µL en una LC equipada con una columna C8 interconectada a un MS/MS. Los analitos se separan e identifican comparando los espectros de masas y los tiempos de retención con los espectros de referencia y los tiempos de retención de los estándares de calibración realizados bajo condiciones idénticas de LC/MS/MS. La concentración de cada analito de interés se determina mediante calibración estándar externa.

B.1.2.4 Alcance y aplicación

Este es un método de cromatografía líquida/espectrometría de masas en tándem (LC/MS/MS) para la determinación de microcistinas y nodularinas (combinado intracelular y extracelular) en agua de uso y consumo humano.

Los datos de exactitud y precisión han sido generados en agua grado reactivo y finalizados en aguas subterráneas y superficiales terminadas para los analitos listados en la Tabla B.1.2-1, de este Apéndice.

Tabla B.1.2-1. Analitos que pueden ser determinados por este método

Analito

Número CAS

Microcistina-La (MC-LA)

96180-79-9

Microcistina-LFA (MC-LF)

154037-70-4

Microcistina-LR (MC-LR)

101043-37-2

Microcistina-LY (MC-LY)

123304-10-9

Microcistina-RR (MC-RR)

111755-37-4

Microcistina-YR (MC-YR)

101064-48-6

Nodularina-R (NOD-R)

118399-22-7


Este método debe de ser utilizado por analistas expertos en extracciones en fase sólida, funcionamiento de los instrumentos de LC/MS/MS y la interpretación de los datos asociados.

En reconocimiento de los avances tecnológicos en sistemas y técnicas analíticas, se permite al laboratorio modificar las técnicas de evaporación, separación, columna LC, composición de fase móvil, condiciones LC y condiciones MS y MS/MS. Sin embargo, no deben de realizarse cambios a la recolección y conservación de muestras, a las etapas de extracción de muestras, ni a los requisitos de control de calidad. Las modificaciones deben ser consideradas sólo para mejorar el rendimiento del método. Modificaciones que son introducidas con el interés de reducir el costo o el tiempo de procesamiento de la muestra, pero dar lugar a un método más pobre no deben utilizarse. Los analitos deben estar adecuadamente resueltos cromatográficamente para permitir que el espectrómetro de masas proporcione un número mínimo de compuestos eluyendo dentro de una ventana de tiempo de retención. La sensibilidad instrumental (señal de ruido) disminuirá si se permite que demasiados compuestos eluyan dentro de una ventana de tiempo de retención. En todos los casos en los que se proponen modificaciones de del método, el analista debe realizar los procedimientos descritos en la demostración inicial de capacidad (IDC), verificar que conoce todos los criterios de aceptación del control de calidad (QC) y que el rendimiento del método aceptable puede verificarse en una matriz de muestra real.

B.1.2.5 Equipos y materiales

Las referencias a marcas específicas y números de catálogo se incluyen sólo como ejemplos y no implican aprobación de los productos. Dicha referencia no excluye el uso de otros proveedores o fabricantes. Las referencias específicas pretenden representar especificaciones adecuadas para los artículos.

Abrazadera metálica. Abrazadera de aluminio de 47 mm (Kimble Chase #953753-0000 o equivalente).

Balanza analítica. Balanza analítica capaz de pesar 0. 000 1 g

Base de filtro O-ring. Anillo de sellado de PTFE /silicona (Kimble Chase # 410171-4226 o equivalente).

Base de soporte. Base de soporte para filtración de vidrio fritado de 47 mm (Kimble Chase # 953752-5047 o equivalente).

Boquilla para manguera. Adaptador de tubo para aparatos de filtración (Kimble Chase #736400-1413 o equivalente).

Cartuchos para dispositivo de SPE. Waters Oasis HLB, 150 mg, 6cc copolímero divinilbenceno N-vinilpirrolidona (Waters # 186003365).

Contenedores de muestra. Botellas de vidrio ámbar de 500 mL con tapa con rosca de politetrafluoroetileno (PTFE).

Columna analítica. Columna LC C8 (2.1x100mm) cargada con partículas de fase sólida C8 de 2.6µm (Phenomenex Kinetex # 00D-4497-AN). Cualquier columna equivalente que proporcione una resolución adecuada, forma de pico, capacidad, exactitud y precisión puede ser usada.

Contenedores para colectar filtrado. Botellas de vidrio ámbar de 500 ml (Fisher #02-542-4C o equivalente) y tapa de botella GL45 (Fisher #13247GL45 o equivalente; No se muestra en la figura).

Dispositivo para filtración. En la Fig. B.1.2-1 de este Apéndice, se indican número de partes:

Fig. B.1.2-1 Partes del dispositivo de filtración

Embudo. Embudo de vidrio de 300 mL de 47 mm (Kimble Chase # 953751-0000 o equivalente).

Espectrómetro de masas en tándem (MS/MS) con sistema de datos. El espectrómetro de masas debe ser capaz de ionizar por ionización por electrospray (ESI) cerca de la tasa de flujo LC sugerida de 0.3 mL/min. El sistema debe ser capaz de realizar MS/MS, para producir iones de producto únicos para métodos de segmento de analitos de tiempo de retención especificados. Un mínimo de 10 exploraciones a través del pico cromatográfico, es necesario para asegurar una precisión adecuada.

Extractor manual. Bomba manual de vacío con modelo de gran volumen Visiprep (Supelco #57030  y # 57275 o equivalente) para cartuchos de extracción.

Filtro de membrana. Membrana nucleoporo de filtro de policarbonato de 47 mm con un tamaño de poro 0.4 µm (Whatman # 111107 o equivalente).

Microjeringas. Los tamaños sugeridos incluyen jeringas de 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500 y 1 000 µL.

Sistema de concentración de extracto. Los extractos se concentran por evaporación con nitrógeno utilizando un baño de agua con una temperatura no mayor a 60 °C (Meyer N-Evap, Modelo 111, Organomation Associates, Inc. o equivalente)

Sistema de datos. Se requiere un sistema de datos interconectado para adquirir, almacenar, reducir y producir datos espectrales de masa. El software de la computadora debe tener la capacidad de procesar datos de LC/MS/MS almacenados, reconociendo un pico de LC dentro de cualquier ventana de tiempo de retención dada. El software debe permitir la integración de la abundancia de iones de cualquier ion específico dentro del tiempo especificado o dentro del límite del número de escaneo. El software debe ser capaz de calcular los factores de respuesta relativa, construir regresiones lineales o curvas cuadráticas de calibración, y calcular las concentraciones del analito de interés.

Sistema de liberación muestras. Se recomienda el uso de un sistema de tubos de transferencia (Supelco "Visiprep", # 57275 o equivalente), para transferir la muestra directamente del contenedor de muestra al cartucho de SPE.

Sistema de vacío de laboratorio o aspirador. Con una capacidad suficiente para mantener un vacío de aproximadamente 10 a 15 pulgadas de mercurio para extraer cartuchos.

Sistema para cromatografía líquida (LC). Instrumento capaz de inyectar de forma reproducible alícuotas de hasta 10 µL y realizar gradientes lineales binarios a un flujo constante cerca del flujo utilizado para el desarrollo de este método (0.3mL/min). El uso de un calentador de columna es opcional.

Tapa de botella con agujero. Tapa GL45 para botella con orificio para la base del soporte del filtro (Kimble # 410170-4534, o equivalente).

Tubos cónicos de centrífuga. Tubos cónicos de centrifugación de vidrio de 15 ml (Corning # 8082-15) u otra cristalería adecuada para recolectar el eluyente de la fase sólida después de la extracción.

Tubos de cultivo de fondo redondo. Tubos de cultivo de fondo redondo de vidrio de 15 ml (Corning # 9826-16X o equivalente) u otra cristalería adecuada para su uso en la liberación de la toxina del filtro.

Viales de automuestreo. Viales de vidrio ámbar de automuestreo de 2 mL (National Scientific #C4000-2W o equivalente) con tapa y septos de PTFE (National Scientific # C4000-53 o equivalente).

B.1.2.6 Reactivos y soluciones

Las referencias a marcas específicas y números de catálogo se incluyen sólo como ejemplos y no implican aprobación de los productos. Dicha referencia no excluye el uso de otros proveedores o fabricantes. Las referencias específicas pretenden representar especificaciones adecuadas para los artículos.

Ácido ethilendiaminotetraacético, sal trisódica. (Trisodium EDTA, no. CAS 10378-22-0). Inhibe la hidrólisis de los analitos catalizada por metales. La sal trisódica se utilizada en lugar de la sal disódica dado que el pH de la solución salina trisódica es más próximo al pH deseado de 7 (Sigma #ED3SS o equivalente). Reactivo para preservación de la muestra. Dado que es sólido a temperatura ambiente, puede añadirse a la botella para la muestra antes de salir a colectar la muestra al campo.

Ácido L-ascórbico. (no. CAS 50-81-7). Reduce el cloro libre en el momento de recolección de la muestra. (Sigma-Aldrich #255564 o equivalente). Reactivo para preservación de la muestra. Dado que es sólido a temperatura ambiente, puede añadirse a la botella para la muestra antes de salir a colectar la muestra  al campo.

Agua grado reactivo. Agua purificada que no contiene ninguna cantidad de sustancia medible de cualquier analitos o compuesto interferente mayor de 1/3 del MRL para cada analito de interés.

Argón. Utilizado como gas de colisión durante experimentos de MS/MS. El argón debe cumplir o exceder las especificaciones del fabricante del instrumento. El gas nitrógeno puede usarse como gas de colisión siempre que se obtenga una sensibilidad suficiente (formación de iones de producto).

Cristales Trizma preempaquetados. Grado de reactivo. Mezcla premezclada de Tris [Tris (hidroximetil)aminometano] y Tris HCL [Tris (hidroximetil)aminometano clorhidrato]. pH 7.0 (Sigma-Aldrich  #T-7193 o equivalente) - Alternativamente, puede usarse una mezcla de los dos componentes con un relación de peso 153.5/1 Tris HCl/Tris. Ambas mezclas son usadas para producir un pH cercano a 7.0 a 25°C en agua grado reactivo. Trizma funciona como una solución amortiguadora. Reactivo para preservación de la muestra. Dado que es sólido a temperatura ambiente, puede añadirse a la botella para la muestra antes de salir a colectar la muestra al campo.

Estándares de calibración (CAL). Preparar una serie de al menos cinco concentraciones de soluciones de calibración en metanol que contiene 10% de agua, a partir de las diluciones de la PDS del analito. Las concentraciones sugeridas son una descripción de las concentraciones usadas durante el desarrollo del método y pueden ser modificadas de acuerdo con la sensibilidad del equipo. Los rangos de concentración utilizados durante el desarrollo del método fueron 10-400 µg/L, excepto para MC-RR (4.7-187.5 µg/L), nodularina-R (4.9 - 195.7 µg/L) y MC-LA (25 - 1 000 µg/L). Los rangos de concentración más grandes requerirán más puntos de calibración. El SUR se agrega a los estándares CAL en una concentración constante. Durante el desarrollo del método, la concentración del SUR fue de 129.8 µg/L en el estándar (259.6 ng/L en la muestra acuosa). La concentración más baja del estándar CAL debe estar en o por debajo del MRL, lo cual depende de la sensibilidad del sistema. Los estándares CAL pueden usarse también como CdC. Durante el desarrollo del método, los estándares CAL se encontraron estables durante dos semanas si se almacena a -4°C o menos. Tiempos más largos de almacenamiento son aceptables siempre y cuando se documenten las medidas de control de calidad demostrando la estabilidad del CAL.

Formiato de amonio. (CH5O2N, no. CAS 540-69-2) - Alta pureza, demostrando estar libre de analitos e interferencias; grado LC/MS (Fluka# 55674) o equivalente).

Gases, reactivos y solventes. Deben ser usados los mejores productos de reactivos químicos, a menos que se indique otra cosa, se pretende que todos los reactivos contengan las especificaciones del Comité de Reactivos Analíticos de la Sociedad Química Americana. Se pueden utilizar otros grados de reactivo, determinando primero que el reactivo sea de pureza suficientemente alta para permitir su uso sin disminuir la calidad de la determinación.

Metanol. (CH3OH, no. CAS 67-56-1) - Alta pureza, demostrando estar libre de analitos e interferencias (Fisher Optima grado LC/MS o equivalente).

Nitrógeno. Ayuda a la generación de aerosoles y a la desolvatación del aerosol líquido en la Ionización por electrospray (ESI) y se utiliza como gas de colisión en algunos equipos MS/MS. El nitrógeno utilizado debe cumplir o exceder las especificaciones del fabricante del instrumento.

Solución amortiguadora de formiato 20mM. Para preparar 1 L, añadir 1.26 g de formiato de amonio a 1 L de agua grado reactivo. Esta solución es propensa a pérdidas de volatilidad y debe ser sustituido por lo menos cada 48 horas.

Soluciones estándar. Cuando la pureza evaluada de un compuesto es igual o mayor al 95%, el peso puede utilizarse sin corrección para el cálculo de concentración de las soluciones estándar. Las concentraciones sugeridas son una descripción de las concentraciones que se utilizan durante el desarrollo del método y pueden ser modificadas para ajustarse a la sensibilidad del equipo que se utilice. Las soluciones estándar para la fortificación de muestras generalmente deben ser preparadas en pequeños volúmenes, que puedan ser medidos con precisión para minimizar la adición de exceso solvente orgánico para las muestras acuosas. Los laboratorios deben utilizar prácticas de control de calidad para determinar cuándo es necesario reemplazar sus soluciones estándar. No deben utilizarse puntas de pipetas de polipropileno para la dosificación de soluciones que contiene analitos de este método, ya que se ha reportado la adsorción de microcistina por el polipropileno.

Soluciones estándar del analito. Las soluciones estándar del analito pueden comprarse comercialmente como soluciones en ampolletas o preparadas a partir de material puro.

Solución estándar del analito (10 - 500 µg/ml). Las cianotoxinas puras son compradas generalmente en cantidades de 10-500µg. Debido a la pequeña cantidad y a la toxicidad de estos analitos, el pesado de las cianotoxinas no es factible. Si se preparan a partir de material puro, simplemente debe añadirse 1 mL de metanol al material puro comprado (10 - 500 µg) para obtener una concentración final de 10 - 500 µg/mL. Repita para analito preparado a partir de material puro. Alternativamente, pueden comprarse soluciones estándar de los analitos preferiblemente en metanol si están disponibles en el mercado. Las soluciones estándar son estables al menos 6 meses si son almacenadas a -15°C o menos en frascos color ámbar de tapa de vidrio.

Soluciones estándar del analito surrogado (SUR). El SUR para este método es la C2D5-MC-LR. Este Sur marcado isotópicamente contiene funciones similares al analito. Aunque pueden usarse soluciones estándar de SUR alternativos siempre que estén marcados isotópicamente con grupos funcionales similares al analito, el analista debe documentar las razones por las cuales utiliza estándares alternativos de SUR. Asimismo, las soluciones estándar de SUR deben de cumplir con los requisitos de control de calidad.

Solución estándar de dilución primaria (PDS) (0.94 - 5.0 ng/µl). La PDS del analito contiene todos o una parte de los analitos de interés a diferentes concentraciones en metanol. La respuesta en ESI y MS/MS varía según el compuesto, por lo tanto, puede ser necesaria una mezcla de concentraciones en la PDS del analito. Durante el desarrollo del método, las soluciones PDS del analito fueron preparadas tal que aproximadamente se obtuvo la misma respuesta del equipo para todos los analitos. La PDS del analito se preparó en metanol a las concentraciones de 0.94 a 5.0 ng/µL. La PDS del analito se prepara por dilución de la combinación de las soluciones de estándar del analito de interés y se utiliza para preparar los estándares CAL y fortalecer los LFB, LFSM, LFSMD y FD con los analitos de interés. La PDS del analito ha demostrado ser estable para un mes cuando se almacena a -15°C o menos en frascos de vidrio ámbar con tapa de rosca.

Tabla B.1.2-2. Determinación de la concentración final del analito en la PDS


Concentración de analito (µg/mL)

Vol. de analito (µL)

Vol. final de la PDS del analito (mL)

Conc. final de la PDS (ng/µL)

Microcistina-LR

500

40.0

10ml

2.0

Microcistina-RR

10.3

910

0.94

Microcistina-YR

100

200

2.0

Microcistina-LY

100

200

2.0

Microcistina-LF

100

200

2.0

Nodularina-R

10.3

950

0.98

Microcistina-LA

100

500

5.0

Solución estándar de dilución primaria del surrogado (PDS SUR; 6.49 ng/µL). La PDS del SUR es preparada por dilución de 64.9 µg de material puro en 10 mL de metano. Esta solución se utiliza para fortificar todas las soluciones de control de calidad y las muestras de campo. Se ha demostrado que el PDS es estable durante al menos un mes cuando se almacena a -15°C o menos. Utilice 20 µL de este PDS SUR con 6.49 ng/µL para fortificar las soluciones acuosas de control de calidad de 500 mL y las muestras de campo antes de la extracción. Esto producirá una concentración de 259.6 ng/L del SUR en las soluciones acuosas de QC y en las muestras de campo. La concentración del SUR puede ajustarse para adaptarse a sensibilidad del equipo.

2-cloroacetamida. (no. CAS 79-07-2) - Inhibe el crecimiento microbiano y la degradación del analito (Sigma-Aldrich # C0267 o equivalente). Reactivo para preservación de la muestra. Dado que es sólido a temperatura ambiente, puede añadirse a la botella para la muestra antes de salir a colectar la muestra al campo.

B.1.2.7 Procedimiento

B.1.2.7.1 Recolección, conservación y almacenamiento de muestras

Recolectar las muestras en botellas de 500 mL de vidrio color ámbar con tapones de rosca con revestimiento de teflón. No utilice botellas para muestras mayores a 500 mL (dado que los pasos de enjuague no son óptimos para tamaños grandes de botella). Tamaños de muestra más pequeños pueden utilizarse ya que el MRL puede ser resuelto, sin embargo, no deben de ser menores a 100 mL. Todo el volumen completo de la muestra en la botella debe ser utilizado (por ejemplo, una alícuota de 100 mL no debe tomarse de una botella de 500 mL porque por que la botella de la muestra debe ser enjuagada).

Los siguientes reactivos para la conservación de la muestra, listados en la Tabla B.1.2-3, de este Apéndice, son añadidos a cada botella de muestra como un sólido antes de su envío al campo o antes de la colecta de la muestra.

Tabla B.1.2-3. Reactivos para conservación de la muestra

Compuesto

Cantidad

Propósito

Trizma

7.75 g/L

Reactivo amortiguador

2-Cloroacetamida

2 g/L

antimicrobiano

Ácido ascórbico

100 mg/L

agente para la eliminación de cloro

Ácido ethilendiaminotetraacético, sal trisódica

0.35 g/L

inhibe la unión de los analitos blanco a metales


Para la recolección de la muestra debe abrir el grifo de agua fría y dejar fluir el sistema hasta que la temperatura del agua se haya estabilizado (aproximadamente 3 a 5 minutos) y entonces debe de tomar la muestra.

Las botellas deben llenarse, teniendo cuidado de no eliminar los reactivos de preservación de la muestra.

Las muestras no necesitan ser colectadas sin que quede espacio libre en el vial o botella de la muestra.

Después de recolectar la muestra, tapar la botella y agitar con la mano hasta que el reactivo para la conservación es disuelto. Tenga en cuenta que el 2-cloroacetamida es lento en disolverse especialmente en agua fría. Mantener la muestra sellada desde el momento de recolección hasta la extracción.

Las muestras deben ser enfriadas durante el envío y no deben exceder los 10 °C durante las primeras 48 horas después de la recolección. Cuando las muestras son recibidas en el laboratorio debe confirmarse que la temperatura de la muestra sea igual o menor a 10 °C. Las muestras almacenadas en el laboratorio deben de conservarse a o por debajo de 6 °C hasta su extracción, pero no deben ser congeladas.

Las muestras que son significativamente superiores a 10 °C, en el momento de la recolección de la muestra, deben ser puestas en hielo o refrigeradas por un período de tiempo, con el fin de enfriarlas antes del envío. Esto permitirá que se envíen con la temperatura adecuada para cubrir con los requisitos anteriores.

Las muestras de agua deberían ser extraídas tan pronto como sea posible después de la recolección, sin embargo, pueden extraídas dentro de 28 días posteriores a la recolección de la muestra. Los extractos deben ser almacenados en -4°C y analizados dentro de los 28 días siguientes a la extracción. Los tiempos de espera para muestra y extracto con el porcentaje de recuperación (% prom REC) y el porcentaje de desviación estándar relativa (%RSD) se presentan en las Tablas B.1.2-4 y B.1.2-5, de este Apéndice.


Tabla B.1.2-4. Tiempos de espera de muestras acuosas para muestras de agua de uso y consumo humano provenientes de fuentes superficiales a, fortificadas con analitos de interés y preservadas y almacenadas de acuerdo con lo establecido en el presente método (n=4).


Día 0

Día 7

Día 14

Día 21

Día 28

Analito

Conc. fortificada (ng/L)

% prom REC

% RSD

% prom REC

% RSD

% prom REC

% RSD

% prom REC

% RSD

% prom REC

% RSD

MC-YR

400.0

101

8.7

92.5

2.2

89.0

6.7

96.4

1.5

95.1

6.1

Nodularina-R

195.7

91.7

3.9

92.0

3.2

94.4

1.6

96.5

2.3

91.6

3.3

MC-RR

187.5

91.7

2.1

94.6

3.4

94.9

1.7

94.9

1.7

90.3

0.6

MC-LR

400.0

89.4

2.3

87.2

2.5

89.4

2.3

90.2

2.1

86.4

1.3

MC-LA

1 000

91.2

0.9

90.6

2.3

87.2

1.8

90.2

1.7

88.1

1.5

MC-LY

400.0

88.4

1.8

87.9

2.0

89.3

1.1

89.9

1.1

88.1

1.9

MC-LF

400.0

89.1

2.3

86.4

1.6

86.6

1.2

86.6

2.2

85.4

2.1

C2D5-MC-LR (SUR) b

259.6

86.9

5.4

92.8

0.7

89.7

3.3

92.8

3.4

92.0

4.1

a TOC= 0.9mg/L; dureza=120mg/L como carbonato de calcio

b No se añadió surrogado a las muestras hasta el día de la extracción


Tabla B.1.2-5. Tiempos de espera de extractos para muestras de agua de uso y consumo humano provenientes de fuentes superficiales, fortificadas con analitos de interés y preservadas y almacenadas de acuerdo con lo establecido en el presente método (n=4).


Día 0

Día 7

Día 14

Día 21

Día 28

Analito

Conc. fortificada (ng/L)

% prom REC

% RSD

% prom REC

% RSD

% prom REC

% RSD

% prom REC

% RSD

% prom REC

% RSD

MC-YR

400.0

101

8.7

98.4

2.4

90.7

5.3

91.3

2.8

95.0

4.9

Nodularina-R

195.7

91.7

3.9

93.9

2.4

94.9

1.8

95.8

2.4

95.1

1.3

MC-RR

187.5

91.7

2.1

98.6

1.7

97.0

2.2

92.6

2.9

92.5

2.1

MC-LR

400.0

89.4

2.3

91.1

2.4

94.4

3.8

90.4

2.7

90.8

1.1

MC-LA

1000

91.2

0.9

93.1

2.5

90.0

0.5

91.7

0.7

92.5

1.9

MC-LY

400.0

88.4

1.8

92.4

2.5

94.4

2.2

91.6

1.8

93.4

1.6

MC-LF

400.0

89.1

2.3

92.6

0.9

89.0

1.8

90.8

1.9

91.0

2.5

C2D5-MC-LR (SUR)

259.6

86.9

5.4

90.9

5.2

89.1

1.4

90.5

3.2

93.2

3.6


B.1.2.7.2 Procedimiento analítico

Este procedimiento se puede realizar manualmente o de forma automatizada mediante un robot o dispositivo de preparación de muestras automático. Puede utilizarse un sistema automático/robótico de preparación de muestras, diseñado para usarse con cartuchos de SPE siempre y cuando cumpla con todos los requisitos de control de calidad. Si se utiliza un sistema automatizado para preparar muestras, debe seguir las instrucciones de fabricante, pero todos los pasos de extracción y la elución deben ser los mismos que en el procedimiento manual. Los pasos de extracción o elución no pueden ser cambiados u omitidos para adecuar el uso de un sistema automatizado. Si se utiliza un sistema automatizado, los LRB deben rotarse entre los puertos para asegurar que todas las válvulas y la tubería cumplan los requisitos de LRB.

Los cartuchos de SPE que se mencionan, están diseñados como elementos de uso individual y deben desecharse después del uso. No pueden ser restaurados o reacondicionados para su reutilización en análisis posteriores.

Las muestras son conservadas, recogidas y almacenadas tal como se mencionó anteriormente. Todas las muestras de campo y de QC, incluyendo el LRB y el LFB, debe contener los conservantes listados en la Tabla B.1.2-3, de este Apéndice. Antes de la extracción, se debe verificar que el pH de la muestra es 7±0.5. Si el pH de la muestra no cumple con este requisito, la muestra debe desecharse. Si el pH de la muestra es aceptable, se debe proceder con el análisis. Antes de la extracción, marque el nivel de la muestra en el exterior de la botella de muestra para posteriormente determinar el volumen de muestra. Si se usa el peso para determinar el volumen, debe pesarse la botella con la muestra recolectada antes de la extracción.

Como se mencionó, se pueden utilizar tamaños de muestra menores para obtener el MRL. Debe usarse el mismo tamaño de muestra para el LFB, FD, LFSM y LFSMD así como para la muestra de campo y todas las muestras de QC las cuales deben cumplir el tamaño de muestra más pequeño.

A cada muestra a ser extraída debe añadirse alícuota de la PDS SUR, tapar e invertir para mezclar. Durante el desarrollo del método, se añade una alícuota de 20 µL de la solución PDS SUR 6.49 ng/µL  a 500 mL para una concentración final de 259.6 ng/L en la muestra acuosa.

Además del SUR y los conservantes, si la muestra es LFB, FD, LFSM o LFSMD, agregar la cantidad necesaria de la PDS del analito, tapar e invertir cada muestra para mezclar.

Para la liberación de la toxina intracelular debe filtrarse la muestra de agua de 500 mL usando un filtro Nuclepore con el lado brilloso hacia arriba y recoger el filtrado en una botella de vidrio color ámbar  de 500 mL2.1) para la extracción.

Enjuagar la botella de la muestra con 5 mL de metanol que contiene un 10% de agua grado reactivo y verter el agua de enjuague en el dispositivo de filtrado y combinar el agua de enjuague con la muestra de agua filtrada.

Enjuagar los lados del embudo con otros 2.5 mL de metanol que contiene un 10% de agua grado reactivo y combinar con la muestra de agua filtrada.

Utilizando pinzas de metal, retire el filtro del dispositivo de filtración y doble el filtro por la mitad (parte superior del filtro hacia adentro) mientras toca únicamente los bordes del filtro. Continúe plegando el filtro hasta que esté lo suficientemente pequeño como para caber en un tubo de vidrio. Empuje el filtro hacia la parte inferior de la probeta de cristal utilizando una pipeta de vidrio.

Añadir 2 mL de metanol que contiene un 20% de agua grado reactivo al tubo de ensayo que contiene el filtro (asegurándose que el filtro se cubre con el líquido) y manualmente agitar el tubo suavemente varias veces.

Coloque el tubo de ensayo que contiene los 2 mL de la solución filtrada y el filtro en un congelador a -20°C por 1 a 16 horas. No exceder de 16 horas en el congelador. Si el filtro se mantiene congelado por más  de 2 horas, los 500 mL del filtrado acuoso se deben mantener refrigerados a 6°C hasta la finalización del procedimiento de liberación de la toxina.

Remover el tubo de prueba del congelador, agitar suavemente un par de veces y luego extraer los 2 mL del líquido con una pipeta de vidrio. Transferir estos 2 mL de líquido a los 500 mL de agua filtrada de la muestra colectada.

Enjuague el filtro y el tubo de ensayo mediante la adición de otros 2 mL de metanol que contiene un 20% de agua grado reactivo al tubo de ensayo y gírelo suavemente. Extraer los 2 mL del líquido utilizando una pipeta de vidrio y transferir estos 2 mL de líquido a los 500 mL de agua filtrada de la muestra colectada.

Enjuagar el filtro una segunda vez mediante la adición de otro 1 mL de metanol que contiene un 20% de agua grado reactivo al tubo de ensayo y agitar suavemente. Extraer el 1 mL de líquido utilizando una pipeta de vidrio y transferir este 1mL del líquido a los 500 mL de agua filtrada de la muestra colectada. Agitar la muestra de 500 mL varias veces para homogeneizar la muestra.

Para la limpieza y acondicionado del cartucho, no permita que el material de empaque del cartucho esté seco en cualquiera de los pasos de condicionamiento. Enjuagar cada cartucho con 15mL de metanol. A continuación, enjuagar cada cartucho con 15 mL de agua grado reactivo, sin permitir que el agua caiga por debajo del borde superior del empaque. Si el cartucho queda seco durante la fase de condicionamiento, debe comenzar de nuevo. Añadir 4 - 5 mL de agua grado reactivo a cada cartucho, colocar tubos de transferencia de muestras, encender la aspiradora y comenzar la adición de la muestra filtrada (que contienen las toxinas intracelulares liberadas) en el cartucho.

Con el fin de realizar una correcta extracción de la muestra, ajuste el vacío para que el caudal aproximado sea de 10 - 15 mL/min. No permita que el cartucho esté seco antes de que toda la muestra pase a través del cartucho.

Para el enjuague de la botella de la muestra y del cartucho, una vez que toda la muestra ha pasado a través del cartucho, enjuague las botellas de muestra con 10 mL de agua grado reactivo y extraiga el enjuague a través de los tubos de transferencia de la muestra y los cartuchos. Retirar los tubos de transferencia de la muestra y lavar los cartuchos con otros 5 mL de agua grado reactivo. Extraer aire o nitrógeno a través del cartucho por 10 min al alto vacío (10 - 15 pulgadas de mercurio).

Para permitir la elución de la botella de la muestra y del cartucho, apague y libere el vacío. Levante la tapa del colector de extracción e inserte un bastidor con tubos de colecta en el tanque de la extracción para recolectar los extractos que se eluyen de los cartuchos. Vuelva a encender la aspiradora, pero asegúrese que el vacío no exceda de 10 de pulgadas de mercurio durante la elución. Enjuague las botellas de muestra con 5 mL de metanol que contiene 10% reactivo agua y eluir los analitos de los cartuchos tirando los 5 mL de metanol (usada para enjuagar las botellas) a través de los tubos de transferencia de la muestra y los cartuchos. Use un aspirado de baja potencia tal que el solvente salga del cartucho de gota en gota. Repita el enjuague de la botella de la muestra y la elución del cartucho con una segunda alícuota de 5 mL de metanol que contiene 10% de agua reactivo.

Los volúmenes de solvente utilizados fueron optimizados para botellas de 500 mL de la muestra. El uso de botellas para muestras más grandes para las muestras de control de calidad no se recomienda dado que puede afectar negativamente la recuperación de analito.

Concentrar el extracto hasta que esté seco bajo una corriente suave de nitrógeno en un baño de agua caliente (60°C). Añadir 1 ml de metanol que contiene 10% de agua reactivo al vial y agitar en vortex. Transferir una alícuota a un vial de automuestreo.

Para determinar el volumen de la muestra, si el nivel de la muestra fue marcado en la botella de la muestra, utilice una probeta graduada para medir el volumen de agua necesaria para llenar la botella de la muestra original hasta la marca que hizo antes de la extracción. Determinar a los 10ml más cercanos. Si se usa el peso para determinar el volumen, pesar la botella vacía a los 10 g de peso y determinar el peso de la muestra por la substracción del peso de la botella vacía del peso de la muestra original. Asumir una densidad de 1 g/mL de muestra. En cualquier caso, el volumen de la muestra se utilizará en el cálculo final de concentración de analito.

Para realizar el análisis del extracto, se deben establecer las condiciones necesarias resumidas en las Tablas B.1.2-6, B.1.2-7, B.1.2-8 y B.1.2-9, de este Apéndice. Columnas y condiciones del instrumento deben optimizarse antes de la iniciación de la IDC.

Tabla B.1.2-6. Condiciones del método LC

Tiempo (min)

Formiato de amonio %20mM

% metanol

inicial

90

10

2.0

90

10

16

20

80

16.1

10

90

22

10

90

22.1

90

10

26

90

10

Columna Phenomenex Kinetex C8, 2.6 µm, 2.1 x 100 mm Rango de flujo de 0.3 mL/min inyección "partial loop" de 10 µL en un loop de 20 µL

Tabla B.1.2-7. Condiciones del método ESI-MS/MS

Condiciones ESI

Polaridad

ion positivo

Voltaje aguja capilar

4 kV

Flojo de gas en cono

25 L/h

Desolvatación del gas nitrógeno

1 000 L/h

Temperatura de la desolvatación del gas

350 °C


Tabla B.1.2-8. Origen del analito y tiempo de retención (RT) a

Analito

Origen del analito

RT (min)

MC-YR

Green Water Laboratories

11.07

Nodularina-R

National Research Council Canada

11.08

MC-RR

National Research Council Canada

11.33

MC-LR

Green Water Laboratories

11.49

MC-LA

Green Water Laboratories

12.41

MC-LY

Enzo Life Sciences

12.51

MC-LF

Enzo Life Sciences

14.05

C2D5-MC-LR (SUR)

Wayne State University. Sintetizado a EPA bajo contracto.

14.3

a Los datos presentados fueron obtenidos utilizando analitos adquiridos comercialmente. Materiales de otros distribuidores pueden ser utilizados demostrando los requerimientos de QC


Tabla B.1.2-9. Condiciones del método MS/MS a

Segmento b

Analito

ion precursor c(m/z)

ion producto d (m/z)

voltaje de cono (v)

energía de colisión e (v)

1

MC-YR

523.4

[M+2H] 2+

134.9

20

15

1

Nodularina-R

825.4

[M+H]+

134.9

45

55

1

MC-RR

519.9

[M+2H] 2+

134.9

35

30

1

MC-LR

995.5

[M+H]+

134.9

60

65

2

MC-LA

910.5

[M+H]+

776.4

40

20

2

MC-LY

1002.5

[M+H]+

134.9

40

60

3

MC-LF

986.5

[M+H]+

134.9

40

60

3

C2D5-MC-LR (SUR)

1028.6

[M+H]+

134.9

55

60

a Un cromatograma ejemplo de los analitos se muestra en la Fig. B.1.1-1

b Los segmentos con duraciones de tiempo en los cuales uno o múltiples eventos de escaneo ocurren.

c Durante la optimización MS y MS/MS, el analista debe determinar las masas del ion precursor y producto a un lugar decimal localizando el lugar del apéndice de los picos de las masas espectrales (p.ej. m/z 523.4 - 134.9 para MC-YR. Estas masas de iones precursores y productos (con un lugar decimal) deben usarse en el método MS/MS para todos los análisis.

d Iones usados con propósito de cuantificación

e Se utilizó argón como gas de colisión en un flujo de 0.3 mL/min

Fig. B.1.2-2 Ejemplo de cromatograma (segmentos MS/MS sobrelapados) de un estándar de calibración con el método 544 de EPA y con analitos en una concentración de 187.5-1 000 ng/L

Se recomienda desviar los primeros 6 a 8 minutos del flujo LC para residuos. Estos extractos contienen pequeñas cantidades de algunos de los conservantes que se diluyen de manera temprana en el cromatograma. Por lo tanto, desviar la porción temprana del análisis minimizará la suciedad de la fuente MS.

Establecer una ventana de tiempo de retención adecuada para cada analito. Esto debe basarse en mediciones de variación de tiempo de retención real para cada parámetro del método en las soluciones estándar CAL en la LC en el transcurso del tiempo. Un valor de más o menos tres veces la desviación estándar del tiempo de retención obtenido para cada analito mientras se establece la calibración inicial y se completa el IDC puede utilizarse para calcular un tamaño de ventana. Sin embargo, la experiencia del analista debe ser considerada de manera importante fuertemente para la determinación del tamaño de la ventana de retención adecuada.

Establecer una calibración inicial válida o confirmar que la calibración es todavía válida ejecutando un CdC. Si se establece una calibración inicial, se debe completar el IDC.

Comenzar analizando las muestras de campo, incluyendo muestras de control de calidad, en su frecuencia apropiada inyectando el mismo tamaño de alícuotas (en el desarrollo del método se utilizó 10 µL), bajo las mismas condiciones usadas para analizar los estándares de CAL.

B.1.2.7.3 Análisis de datos y cálculos

En la conclusión de adquisición de datos, usar el mismo software que se utilizó en el procedimiento de calibración para identificar los picos de interés en el tiempo de retención determinado. Utilizar el software del sistema de datos para examinar las concentraciones de iones de los picos en el cromatograma. Identificar un analito por comparación de su tiempo de retención con el del pico del analito de interés correspondiente en un estándar de referencia.

El analista no debe extrapolar más allá del rango de calibración establecida. Si un área del pico del analito de interés excede el rango de la curva de calibración inicial, el extracto puede ser diluido con metanol que contiene 10% de agua. Volver a inyectar el extracto diluido. Incorporar el factor de dilución en los cálculos de concentración final. El rendimiento aceptable del SUR debe determinarse a partir del extracto de la muestra sin diluir. Los datos resultantes deben ser documentados como una dilución y el MRL debe ajustarse de acuerdo a ello.

B.1.2.7.4 Informe de prueba

Reportar la concentración de microcistina-LR en µg/L.

B.1.2.8 Seguridad

Cada reactivo utilizado en estos procedimientos debe ser tratado como un riesgo potencial para la salud y la exposición a estos materiales debe ser minimizada. Cada laboratorio es responsable de mantener un conocimiento de las regulaciones respecto a la manipulación segura de cualquier producto químico usado en este método. Debe ponerse a disposición de todo el personal involucrado en el análisis las hojas de datos de seguridad de los productos químicos. Algunas directrices de descontaminación/inactivación de toxinas pueden encontrarse en el libro “Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories” y en otras referencias disponibles adicionales referentes a la seguridad del laboratorio.

Los materiales estándar puros y las soluciones estándar de los analitos deben ser manejados con la protección adecuada para la piel y los ojos y se debe tener cuidado de no respirar los vapores o ingerir los materiales.

B.1.2.9 Referencias

       American Chemical Society Publication. “Safety in Academic Chemistry Laboratories,” Committee on Chemical Safety, 7th Edition. Disponible en:

       https://www.acs.org/content/dam/acsorg/about/governance/committees/chemicalsafety/publications/ safety-in-academic-chemistry-laboratories-faculty.pdf (revisado el 17 de marzo de 2017).

       EPA. 2015. METHOD 544. DETERMINATION OF MICROCYSTINS AND NODULARIN IN DRINKING WATER BY SOLID PHASE EXTRACTION AND LIQUID CHROMATOGRAPHY/TANDEM MASS SPECTROMETRY (LC/MS/MS)

       Occupational Safety and Health Administration OSHA “OSHA Safety and Health Standards, General Industry”.

       U.S. Department of Health and Human Services, Public Health Service Centers for Disease Control and Prevention, National Institutes of Health. 2009. “Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories”, 5th edition, Appendix I Guidelines for Work with Toxins of Biological Origin.

       Disponible en https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/BMBL.pdf (revisado 17 de marzo de 2017).

B.1.3 MÉTODO PARA LA DETERMINACIÓN DE MICROCISTINA MEDIANTE SPE Y LA CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTO RENDIMIENTO (HPLC) CON DETECCIÓN (UV) ULTRAVIOLETA

B.1.3.1 Símbolos y términos abreviados

cm        centímetro

hPa        hectoPascal

HPLC        cromatografía de líquidos de alta resolución

kHz        kilohertz

MC        microcistina

MC-LR        microcistina-LR

MC-RR        microcistina-RR

MC-YR        microcistina-YR

min-1        por minuto

NaClO        hipoclorito sódico concentrado

PDA        arreglo de diodo

psi        libra por pulgada cuadrada

SEC        cromatografía de exclusión por tamaño

SIM        monitoreo selectivo de iones

SPE        extracción en fase sólida

TFA        ácido trifluoroacético

UV        ultravioleta

B.1.3.2 Principio

Las muestras de agua que contienen material o biomasa de cianobacterias deben ser filtradas primero. La biomasa se extrae por separado con un solvente (metanol/agua). El extracto es filtrado, diluido y se lleva a cabo una SPE para limpiar de muestra. El filtrado se trata como una muestra de agua pura. Las muestras de agua pura, así como muestras de agua de sistemas de abastecimiento se enriquecen usando SPE. Las microcistinas se eluyen de los cartuchos de SPE con una solución metanol/agua (90/10 volumen/volumen) que contiene 0.1% de TFA. La microcistina se cuantifica por cromatografía de líquidos de alta resolución, de fase reversa HPLC con detector ultravioleta y/o arreglo de diodos a 238 nm.

B.1.3.3 Alcance y aplicación

Este es un método para la determinación y cuantificación de microcistinas en muestras de agua colectadas a la entrada del sistema de tratamiento (que contiene biomasa) y de agua después del proceso de tratamiento, como es el agua en los sistemas de abastecimiento de agua de uso y consumo humano. El método descrito está validado para MC-RR, MC-YR y MC-LR. También es aplicable para la determinación de diversas variantes estructurales de las microcistinas, sin embargo, en estos casos, no puede realizarse una identificación inequívoca debido a la falta de estándares disponibles en el mercado y debido a la coelución.

El valor de umbral de 1 µg/L de MC-LR en agua, puede ser seguido después del enriquecimiento con microcistina mediante SPE.

B.1.3.4 Equipos y materiales

En algunos casos se realizan referencias a marcas específicas y números de catálogo, sin embargo, estos se incluyen sólo como ejemplos y no implican aprobación de los productos. Dicha referencia no excluye el uso de otros proveedores o fabricantes. Las referencias específicas pretenden representar especificaciones adecuadas para los artículos. Algunos elementos de cristalería de laboratorio y equipo no se especifican, ya que su elección dependerá de las aplicaciones específicas y las circunstancias.

Debe evitarse el uso de plásticos siempre que sea posible. Esto es necesario porque el uso de plásticos (por ejemplo pipetas de plástico, tubos de plástico o cartuchos de plástico) puede causar pérdidas de microcistinas por absorción en las paredes de la superficie.

Agitador horizontal ajustable. Necesario sólo para el análisis de muestras que contiene fitoplancton.

Baño ultrasónico

Bomba binaria de HPLC. Adecuada para tasas de flujo de volumen entre 0.3 mL/min y 1 mL/min.

Bomba de vacío para SPE

Botellas de muestreo. Vidrio ámbar, estéril y previamente limpio.

Cartuchos de SPE para el enriquecimiento de microcistina. La columna debe tener una capacidad mínima (cantidad de analito a ser retenido en la columna) no menor a 100 µg de cada microcistina y permitirá una recuperación no menor del 80% para MC-LR, así como no menor del 70% para el MC-RR y MC-YR cuando se aplica como una solución estándar en agua que contiene 0.05 µg de cada microcistina.

La recuperación depende fuertemente de la marca y material del cartucho de SPE y de las especificaciones de los materiales como la carga de carbono, el tamaño de partícula etcétera. Los datos de recuperación se basan en cartuchos C-18 determinados por una sola medición. El cartucho debe tener las siguientes especificaciones de materiales: carga de carbón (16.9%), diámetro de la partícula (54 µm), cobertura de superficie (333 µg/m² basada en el %C) volumen de cartucho (3 ml), material por cartucho (500 mg). Si los valores de recuperación no pueden ser alcanzados, se recomienda cambiar la marca del cartucho SPE.

Cartuchos de SPE de tipo disco pueden también utilizarse para el enriquecimiento de microcistina de muestras de agua.

Centrífuga de laboratorio. 4000 min-1, fuerza centrífuga relativa (RCF) 10000g. Es recomendable el uso de una centrífuga a prueba de explosiones debido al uso de disolventes de extracción inflamables.

Columna de HPLC. (p.ej. columna C18), empacada con material con un tamaño de partícula de 3 a 5µm; con un diámetro interior de 2 a 4.6 mm; y una longitud de 250 mm para asegurar la resolución de los estándares de referencia de MC-LR, MC-YR y MCRR. Debe utilizarse un protector de columna adecuado.  El rango de presión debe ser de 70 000 hPa a 200 000 hPa (1 015 psi a 2 900 psi).

Depósito de SPE. Capacidad de 500mL con conector para cartuchos.

Detector de UV/arreglo de diodo (PDA). Con una longitud de onda λ=238 nm incluyendo corrección de fondo. El rango de longitud de onda de la PDA debe ser de 200 a 300 nm. El límite de detección (LOD) para el sistema debe ser 0.1 ng/µl (relación señal-ruido=3) y el límite de cuantificación (LOQ) debe ser 0.2 ng/µl (relación señal-ruido= 6) para cada microcistina (utilizando una solución estándar).

Dispositivo de calefacción con control de temperatura y unidad de suministro de gas de nitrógeno. Con las siguientes características: Bloqueo de temperatura 30 a 50°C; temperatura del gas ~20° C; pureza de gas 99.996%.

Horno de columna HPLC. Con unidad de control de temperatura (35 °C).

Papel de filtro de microfibra de vidrio. Tamaño de retención de 1 a 2 µm. El diámetro máximo del filtro debe ser de 47mm. La filtración es necesaria sólo para el análisis de las muestras que contienen fitoplancton.

Sonda ultrasónica. Con características de ~60W, ~20 kHz

Sistema de inyección. Con rango de volumen de inyección de 5 a 20µl.

Unidad de filtro desechable. Tamaño de poro <0.45 µm Antes de usarlo, verifique a través de una prueba de recuperación que no existen pérdidas de microcistina durante la filtración. Existe la posibilidad de que diversos materiales puedan retener microcistinas. Opcionalmente puede utilizarse una microcentrífuga para evitar pérdidas.

B.1.3.5 Reactivos y soluciones

Use solamente reactivos de grado analítico reconocido y agua con grado 3, a menos que se especifique lo contrario.

Acetonitrilo. CH3CN, grado HPLC

Ácido de trifluoroacético. TFA, CF3COOH.

Gradiente de fase móvil HPLC. Ejemplo en Tabla B.1.3-1, de este Apéndice.

Tabla B.1.3-1. Gradiente de fase móvil de HPLC

Tiempo (min)

Solución de fase móvil HPLC (A) Acetonitrilo con 0.05%TFA (%)

Solución de fase móvil HPLC (B) Agua con 0.05%TFA (%)

Rango de flujo del volumen total, dependiendo de la columna (mL/min)

0

30

70

0.3 a 1.0

10

35

65

0.3 a 1.0

40

70

30

0.3 a 1.0

42

100

0

0.3 a 1.0

44

100

0

0.3 a 1.0

46

30

70

0.3 a 1.0

55

30

70

0.3 a 1.0


Metanol. CH3OH, grado HPLC

Microcistina. Comercialmente disponible en ampolletas. La calidad de la microcistina comercialmente disponible es muy variable, por lo que se recomienda realizar las soluciones de microcistina como se menciona en este documento.

Solución de elución SPE. Metanol/agua (90/10 volumen/volumen) que contiene 0.1% de TFA.

Solución estándar para dilución. Solvente de enjuague SPE y solvente de re-disolución. Metanol/agua (20/80 volumen/volumen).

Solución de extracción. Metanol/agua (75/25 volumen/volumen).

Solución de fase móvil HPLC (A). En un matraz volumétrico a 1 000 mL, añadir 800 mL de acetonitrilo y 500 µl de TFA y llevar al volumen final con acetonitrilo. Transferir esta solución en una botella  de HPLC-eluyente. Desgasificar la solución antes de usar. Esta solución es estable a temperatura ambiente durante 3 semanas.

Solución de fase móvil HPLC (B). En un matraz volumétrico de 1 000 mL, añadir 800 mL de agua  y 500 µl de TFA y llevar al volumen final con agua. Transferir esta solución en una botella de HPLC-eluyente. Desgasificar la solución antes de usar. Esta solución es estable a temperatura ambiente durante 2 semanas.

Solución de hidróxido de amonio. Solución de hidróxido de amonio NH4OH comercialmente  disponible ~1 mol/L. Se puede realizar la preparación de la solución partiendo de NH4OH concentrado.

Solución de microcistina. Para determinar la concentración exacta de microcistina, para cada solución disolver en metanol puro la microcistina individual suministrada por el proveedor. Registrar la curva de absorción entre 220 y 250 nm en celdas de cuarzo de 1 cm en un espectrofotómetro con metanol en la celda de referencia. Calcular la concentración en masa de cada microcistina, ρi, en microgramos por mililitro, µg/mL, utilizando la ecuación:

En donde:

Amax        absorbancia determinada en el máximo de la curva de absorción

M        masa molar de cada microcistina, en gramos por mol; g/mol

Ɛ        absortividad molar de cada microcistina en metanol, en litros por (mol x centímetro);  L/ (mol x cm)

d        longitud de camino óptico de la celda en centímetros, cm

1000        factor de cálculo para alcanzar la unidad de microgramos por mililitro, μg/mL

La M y la Ɛ se listan en la Tabla B.1.3-2, de este Apéndice.

Tabla B.1.3-2. Masa Molar y la absortividad molar de microcistinas (en metanol, a 238nm)

Microcistina

M

g mol -1

Ɛ

L mol-1 cm-1

MC-LR

994

39 800

MC-YD

1 044

39 800

MC-RR

1 037

39 800

Datos tomados de Bloom J.F. et al. 2001


Para posteriores análisis HPLC, la proporción de solvente metanol/agua para los estándares de MC-LR, MC-YR y MC-RR se pueden ajustar a 20/80 volumen/volumen agregando el agua y permitiendo una concentración de 10 µg/ml para cada microcistina.

Solución de tiosulfato de sodio. Disolver 1 g de tiosulfato de sodio Na2S2O3 (anhidro o con 5 H2O) en 100 mL de agua. La concentración final es ρ=10/L (63 mmolar 63 en caso de Na2SO3 anhidro).

Solución enriquecida para control del método. Preparar una solución enriquecida pipeteando 200 µl de la solución estándar mixta de microcistina en un matraz aforado de 500 mL. Diluir hasta la marca con agua (agua del sistema de abastecimiento o blanco de agua de fuente natural) y agitar bien. La concentración de esta salteada enriquecida es de 1 µg/L para MC-LR, MC-YR y MC-RR.

Solución estándar mixta de microcistina. Pipetear los volúmenes de la solución de microcistina referidos en la Tabla B.1.3-3, de este Apéndice, en viales de 1 mL. Añadir a cada frasco, el volumen de la solución estándar para dilución referido en la Tabla B.1.3-3, de este Apéndice, para alcanzar un volumen final de 1000 µl y agitar bien.

Tabla B.1.3-3. Esquema de pipeteo para las soluciones estándar mixta de microcistina

Solución estándar

Volumen de retirada de cada solución de microcistina (MC-LR,  MC-YR, MC-RR)

(µl)

Volumen de la solución estándar para dilución a añadir para alcanzar un volumen final de 1000µl

(µl)

Concentración de solución estándar

(µg/mL)

MC-LR

MC-YR

MC-RR

1

20

940

0.2

0.2

0.2

2

40

880

0.4

0.4

0.4

3

100

700

1.0

1.0

1.0

4

200

400

2.0

2.0

2.0

5

300

100

3.0

3.0

3.0

Solución mixta de microcistina. Preparar una solución estándar que contenga 2.5 µg/mL de cada microcistina (MC-LR, MC-YR, MC-RR) en la solución de dilución estándar. Almacenar por debajo de -16°C. Para evitar la incorporación de agua por la condensación, no abrir el frasco hasta que el contenido haya alcanzado la temperatura ambiente. Si la solución debe ser almacenada durante un largo periodo, use un frasco hermético. En caso de duda, pesar el frasco y registrar cualquier cambio en la masa durante el almacenamiento.

B.1.3.6 Procedimiento

B.1.3.6.1 Recolección, conservación y almacenamiento de muestras

Recolectar las muestras de agua y almacenarlas no más de 48 horas en un lugar oscuro y fresco  (4 a 8°C).

B.1.3.6.2 Procedimiento analítico

Antes del acondicionamiento, ajustar el cartucho SPE a temperatura ambiente. Para el acondicionamiento, deben de seguirse las especificaciones del fabricante. Sin embargo, si no se indican, pasar 4mL de metanol grado HPLC a través del cartucho. Posteriormente pasar 4 mL de agua a través del cartucho. Permitir un flujo de los solventes a una tasa <10 mL/min a través de la columna y asegurarse de que una pequeña porción del solvente permanezca en la cima de la columna hasta que se aplique la solución de la muestra.

Para la preparación de la muestra, si ésta se trata de agua del sistema de abastecimiento que ha pasado por un sistema de tratamiento, debe concentrarse la microcistina en las muestras de agua mediante la extracción en fase sólida. Si se trata de muestras de agua antes de entrar al tratamiento que puede contener fitoplancton, primero pasar la muestra (volumen recomendado: 50 a 100 mL) a través de un filtro (papel de filtro de microfibra de vidrio) para separar la biomasa de la fracción líquida. Si existen capas de algas flotantes un filtro puede ser insuficiente para la filtración de los 50 mL de agua. En este caso, reemplace inmediatamente el filtro tapado con uno nuevo. Concentrar la microcistina en las muestras de agua mediante la extracción en fase sólida.

Extraer la biomasa en un filtro por separado seguido de la limpieza del extracto antes del análisis de HPLC. Si se usa un filtro gravimétrico, se puede determinar la masa de la biomasa y el contenido de microcistina puede ser mostrado en microgramos por gramo (µg/g).

Para la extracción de microcistinas de las células en el filtro, deben extraerse las células en el filtro (si se usa más de un filtro, combinar los filtros), enjuagando el filtro(s) tres veces con 3 ml de la solución de extracción. Sonicar la solución en hielo durante 2 minutos con una sonda ultrasónica o en un baño ultrasónico. Después de eso, centrifugar la solución a 4000 min-1 durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de la centrifugación, reunir los sobrenadantes y secar 1mL de esta solución bajo una corriente de nitrógeno (40 °C). Antes de limpiar, disolver nuevamente los extractos en 500 µL de solución estándar de dilución y someter a ultrasonidos la muestra en un baño durante 5 minutos.

Para el enriquecimiento de microcistina mediante la SPE, con el fin de evitar pérdidas, debe asegurarse que el pH de la muestra de agua está en el rango de 5.0 a 8.0. Si el pH está fuera de este rango, ajustar con ácido trifluoroacético o con solución de hidróxido de amonio, según corresponda. Añadir 500 µL de solución de tiosulfato de sodio a 500 mL de filtrado de agua de la muestra. Agitar bien y dejar reposar la mezcla durante 5 minutos. Añadir 5 mL de metanol grado HPLC y después de agitar, aplicar al cartucho acondicionado a una velocidad de flujo de 10 mL/min o menos (gotas visibles). Una vez que la muestra de agua ha pasado a través del cartucho, lavar el cartucho con 4mL de solución de dilución estándar. Eluir las microcistinas enriquecidas ya sea con 2.0 mL de solución de elución de SPE en un vial de vidrio de 4 mL (o siga las indicaciones del proveedor). Evaporar el eluyente hasta la sequedad con una corriente de nitrógeno (40 °C). Redisolver en 500 µL de solución estándar de dilución y someter a la muestra durante 5 min en un baño de ultrasonidos. Analizar este extracto directamente con HPLC.

Para la limpieza de microcistinas mediante la SPE, aplicar las microcistinas extraídas aplican a la parte superior cartucho acondicionado y enjuagar el vial del extracto con 500 µL adicionales de solución estándar de dilución y aplicarlo también en la parte superior del cartucho. Después de que el líquido ha pasado a través del cartucho, enjuagar con 4 mL de solución de dilución estándar y desechar el eluido. Cuando la solución de enjuague haya pasado a través del cartucho, eluir las microcistinas limpias según las recomendaciones del proveedor, por ejemplo 2.0 mL de solución de elución de SPE en un vial de vidrio de 4 mL. Evaporar el eluyente hasta la sequedad con una corriente de nitrógeno (40°C), volver a disolver en 500 µL de solución estándar de dilución) y someter a ultrasonidos la muestra en un baño durante 5 minutos. Si la dilución de la muestra es necesaria, diluir 100 µL del extracto de muestra con 900 µL de solución estándar de dilución. Si la limpieza de cartuchos no reduce la coelución, pueden utilizarse como técnicas alternativas la cromatografía por exclusión de tamaño (SEC), la limpieza con columnas de inmunoafinidad o mediante el uso de materiales poliméricos.

Para garantizar la máxima precisión durante la cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC), inyectar las microcistinas purificadas o enriquecidas según las instrucciones del fabricante en el puerto de inyección o válvula de inyección. Separar las microcistinas por HPLC a 35 °C con una columna de fase reversa utilizando el gradiente. Ajustar el flujo de volumen y el volumen de inyección según las dimensiones de la columna (diámetro interno, tamaño de partícula) para obtener la forma óptima de pico y resolución. Las microcistinas eluyen en el orden MC-RR, MC-YR y MC-LR y deben ser resueltas en línea base.

Determinar los espectros de absorción entre 200 y 300 nm para confirmar la identificación, en la Fig. B.1.3-1 y Fig. B.1.3-2, de este Apéndice, se muestra respectivamente un cromatograma típico y los espectros de absorción típicos de microcistinas con detección de PDA.

Fig. B.1.3-1 Cromatograma típico de MC-RR (9.91 min), MC-YR (11.21 min) y MC-LR (12.461 min) en una muestra de agua enriquecida después de SPE (concentración en la muestra de agua 1 000 ng/L)

Condiciones de operación

Volumen de inyección: 20 µl

Columna: Phenomenex, LUNA, C18(2), 250 × 4.6 mm, 3 µm

Tasa de flujo del volumen: 0.7 mL/min

Fase móvil: Agua conteniendo 0.05%TFA; acetonitrilo conteniendo 0.05%TFA

Detección: PDA a 238 nm

Fig. B.1.3-2 Espectros de absorción típica de MC-RR, MC-YR y MC-LR en un sistema de acetonitrilo/agua.

Condiciones de operación

Detección: HPLC-PDA

Celda: Cuarzo

B.1.3.6.3 Análisis de datos y cálculos

Para calcular los resultados de las muestras de agua, se debe de calcular la concentración en masa de cada microcistina en microgramos por litro de la muestra según la siguiente ecuación, después de resolver la ecuación de la curva de calibración para cada microcistina:

En donde:

ρ microcistina,diss        concentración en masa de cada microcistina individual en microgramos por litro μg/L

Vd        volumen de re-disolución de la muestra después de SPE en mililitros, mL

Vsamp        volumen de la muestra de agua aplicada en el cartucho SPE en litros, L

y,b,m        ver ecuación de curva de calibración

Para calcular los resultados de biomasa, se debe calcular la concentración en masa de cada microcistina en fitoplancton en microgramos por mililitro de la muestra según la siguiente ecuación, después de resolver la ecuación de la curva de calibración para cada microcistina:

En donde:

ρ microcistina,dpart        concentración en masa de cada microcistina individual en materia particulada en microgramos por mililitro, μg/mL

Vex        volumen de extracción en mililitros, mL

Vsam        volumen de la muestra filtrada en mililitro, mL

f        factor de dilución en el paso de extracción de la célula;

y,b,m        ver ecuación de curva de calibración

Como alternativa, puede utilizarse una cuantificación asistida por sistemas de cómputo.

Reportar los resultados de las ecuaciones del punto B.1.3.6.3, de este Apéndice, por separado. Los resultados deben de ser sumados para muestras que contienen fitoplancton. Bajo condiciones naturales, la mayoría de las microcistinas están incluidas en el material particulado y generalmente menos del 20% está disuelta en el agua.

Distintas microcistinas MC-RR, MC-YR y MC-LR pueden ser identificadas/reconocidas por sus espectros de absorción ultravioleta. En el caso de microcistinas diferentes a MC-LR, sus concentraciones en masa se pueden calcular utilizando la curva de calibración de MC-LR y los resultados se reportan como equivalentes MC-LR.

B.1.3.6.4 Informe de prueba

Reportar la concentración de microcistina-LR en µg/L.

B.1.3.7 Calibración

Determinar las señales cromatográficas a 238 nm (alturas de pico o áreas) de cada compuesto en la solución estándar mezclada de microcistina.

Preparar las tres curvas de calibración (MC-RR, MC-YR y MC-LR) mediante la inyección de un volumen apropiado (5 a 20 µl) de las mezclas de microcistina descritas en los estándares de soluciones. Estas soluciones cubren el rango de 0.2 µg/ml a 3 µg/ml.

Establecer la curva de calibración (método de mínimos cuadrados) para cada microcistina (área en el eje y y concentración en el eje x) utilizando una regresión lineal mostrada en la siguiente ecuación y verificando el trazo de linealidad.

En donde:

b        punto de intercepción con el eje y (área); ordenada al origen

m        pendiente en mL por microgramos, ml/µg

x        valor del eje x en microgramos por mL, µg/mL

y        valor del eje y (área)

El rango de trabajo se define como la parte lineal de la curva de calibración. Si el contenido de microcistina en las muestras se sitúa fuera del rango de calibración, ajustar el rango de calibración según las muestras. Alternativamente, puede diluirse la solución de inyección para el análisis HPLC con solución estándar de dilución a una concentración de microcistina apropiada para la curva de calibración establecida. Las diferencias en la concentración de metanol de la solución de inyección pueden tener un efecto en la cuantificación.

Para la determinación de la recuperación, se debe efectuar el registro con la solución enriquecida. El nivel de picos debe estar dentro del rango de calibración (preferiblemente valores medios).

B.1.3.8 Seguridad

El método requiere el uso de soluciones que contienen microcistina. Las microcistinas son altamente hepatotóxicas para los seres humanos. Los residuos de microcistinas de laboratorio se recogerán por separado y se tratarán como residuos químicos altamente tóxicos. La descontaminación a largo plazo con hipoclorito sódico concentrado (NaClO) también es posible. Las personas que utilicen este método deben estar familiarizadas con las prácticas normales de laboratorio. Es responsabilidad del usuario establecer prácticas apropiadas de seguridad y salud y de cumplimiento de las condiciones reglamentarias. Es absolutamente esencial que los ensayos realizados de acuerdo con esta norma sean llevados por personal debidamente capacitado.

B.1.3.9 Referencias

       Blom, J.F.; Robinson, J.A.; y Jüttner, F. 2001. High grazer toxicity of [D-Asp3, (E)-Dhb7] microcystin-RR of Planktothrix rubescens as compared to different microcystins. Toxicon, 39, pp. 1923-1932

       International Organization for Standardization. 2005. Water quality- Determination of microcystins - Method using solid phase extraction (SPE) and high performance liquid Chromatography (HPLC) with ultraviolet (UV) detection.

B.2 MÉTODO DE PRUEBA PARA LA DETERMINACIÓN DE QUISTES DE Giardia lamblia  EN AGUA PARA USO Y CONSUMO HUMANO

Giardia lamblia es un protozoario flagelado que se encuentra en las heces del hombre y animales más a menudo en la etapa de quistes, aunque en casos severos de diarrea acuosa se puede presentar la forma reproductiva o trofozoito. Este protozoario es el agente etiológico de la giardiasis y se ha observado que la ingestión de tan sólo 10 quistes puede provocar la infección en humanos, sin embargo, es posible que el consumo de una cantidad menor de quistes viables en agua para beber sea suficiente para iniciar  una infección.

Los quistes de Giardia lamblia pueden sobrevivir en agua para uso y consumo humano por más de 2 meses a 8°C, por lo que la contaminación de las fuentes de abastecimiento de agua con materia fecal podría ocasionar brotes de giardiasis en la población expuesta a dicha agua. Los quistes de Giardia lamblia son más resistentes a la desinfección que las bacterias coliformes. La mayoría de los brotes asociados con fuentes de abastecimiento de agua y aguas de tipo recreacional han ocurrido como resultado de la ingestión de aguas superficiales que únicamente han sido cloradas, sin embargo, pueden ser removidos bajo procesos de potabilización adecuados.

En los sistemas de abastecimiento de agua, la concentración de quistes de Giardia lamblia es relativamente baja, por lo que el análisis de muestras de agua de uso y consumo humano requiere métodos de muestreo que incluyan la concentración de quistes de Giardia lamblia a partir de grandes volúmenes (L) de agua filtrando a través de arena, membranas o filtros microporosos profundos.

De manera posterior a la toma de muestra, es necesario llevar a cabo la purificación de los quistes que se encuentran en la muestra y que se han sedimentado, esto generalmente a través de técnicas de flotación utilizando soluciones de sulfato de zinc, sacarosa, citrato de potasio o Percoll-sacarosa.

A partir de los quistes purificados puede realizarse la determinación a través de observación microscópica usando cromógenos o técnicas de tinción con anticuerpos fluorescentes y criterios morfológicos.

Por lo anterior, para fines del cumplimiento de esta Norma a continuación se describen los siguientes métodos:

       Método de muestreo para la determinación de quistes de Giardia lamblia en muestras de agua para uso y consumo humano (contenido en el punto B.2.1, de este Apéndice).

       Método de purificación de quistes de Giardia lamblia en muestras de agua para uso y consumo humano (contenido en el punto B.2.2, de este Apéndice).

       Método microbiológico para la determinación de quistes de Giardia lamblia en muestras de agua para uso y consumo humano (contenido en el punto B.2.3, de este Apéndice).

Los avances en la investigación y la atención de sospechas de brotes de enfermedades transmitidas por agua han permitido el desarrollo de diversos métodos de prueba para la determinación de quistes de Giardia lamblia en agua para uso y consumo humano. Estos métodos evolucionan rápidamente, por lo que para el cumplimiento de esta Norma para la determinación de quistes de Giardia lamblia en muestras de agua para uso y consumo humano se podrán utilizar de manera indistinta, el método microbiológico descrito en el punto B.2.3, de este Apéndice y las técnicas de inmunofluorescencia (contenido en el punto B.2.4, de este Apéndice) o de biología molecular (contenido en el punto B.2.5, de este Apéndice) descritas en este método de prueba.

B.2.1 MÉTODO DE MUESTREO PARA LA DETERMINACIÓN DE QUISTES DE Giardia lamblia EN MUESTRAS DE AGUA PARA USO Y CONSUMO HUMANO

B.2.1.1 Principio

El presente método incluye la toma de muestra en campo después del proceso de potabilización. La toma de muestra en sitio incluye la concentración de los quistes a través de un cartucho filtrante partiendo de un volumen de agua suficiente para la determinación de quistes de Giardia lamblia, así como la preservación de la muestra hasta su entrega al laboratorio.

B.2.1.2 Alcance y aplicación

Este método describe el procedimiento de muestreo-concentración en campo de agua después del proceso de potabilización y la preservación de la muestra hasta la entrega al laboratorio del cartucho filtrante para la determinación de quistes de Giardia lamblia presentes en muestras de agua para uso y consumo humano.

B.2.1.3 Equipos y materiales

Las referencias a marcas específicas y números de catálogo se incluyen sólo como ejemplos y no implican aprobación de los productos. Dicha referencia no excluye el uso de otros proveedores o fabricantes. Las referencias específicas pretenden representar especificaciones adecuadas para los artículos.

Bolsas para muestreo de cierre hermético de 1 600 a 3 000 mL.

Conexión hembra para manguera con rosca.

Conexión macho para manguera con rosca o conexiones de ensamble rápido macho y hembra, para el módulo de entrada (los diámetros de las conexiones y el tipo de rosca dependerán de las medidas del portacartucho que utilice).

Hielera de tamaño adecuado para la cantidad de muestras a transportar.

Llave para limitar el flujo de salida

Manguera de jardín, transparente (longitud suficiente para realizar las conexiones de entrada y descarga).

Material filtrante. Puede ser un cartucho filtrante de hilo encordado (de fibras acrílicas, de polipropileno u otro material disponible que no libere fibras) de 25 cm de longitud y una porosidad de 1 µm o pueden utilizarse membranas de filtración con poro de 1 µm. El uso de un cartucho filtrante de hilo o de una membrana de filtración dependerá del dispositivo de muestreo que se ensamble.

Medidor de flujo

Motobomba de gasolina o eléctrica, en caso de que la muestra deba colectarse de tanques, estanques de almacenamiento o desde flujos después de la potabilización que no permitan la toma de muestra mediante una conexión o dispositivo de muestreo en la planta de potabilización, o bien, cuando la presión en la línea sea menor a 100 kilopascales (kPa). La motobomba debe ser instalada al final del módulo de salida para evitar el riesgo de contaminación cruzada de muestras previamente filtradas.

Porta cartucho de polietileno, polipropileno, policarbonato u otro material disponible, capaz de contener un filtro cartucho de 25 cm de longitud.

B.2.1.4 Procedimiento

B.2.1.4.1 Procedimiento de muestreo

Ensamblar el dispositivo de muestreo como se muestra en la Fig. B.2.1-1a. En caso de que se cuente con una conexión para muestreo a la salida de la planta de potabilización, conectar a ella el dispositivo (Fig. B.2.1-1a, de este Apéndice). En caso de que no se cuente con una conexión para muestreo a la salida de la planta de potabilización, introducir la manguera en el cuerpo de agua posterior a la potabilización de donde se va a tomar la muestra y conectar la motobomba a la salida del dispositivo después del módulo de descarga (Fig.B.2.1-1b, de este Apéndice).

Fig. B.2.1-1 Dispositivo de muestreo. 1a) en caso de existir conexión para muestreo a la salida de la planta de potabilización. 1b) en caso de no existir conexión para muestreo a la salida de la planta de potabilización.

Permitir el flujo del agua a través del dispositivo de muestreo abriendo la llave de la conexión para muestreo o en su caso encender la motobomba.

Regular el flujo a una tasa aproximada de 3.8 L/min con la llave de la conexión para muestreo de la planta de potabilización y regulando la potencia de la motobomba.

La dirección del flujo del agua debe ser desde la superficie externa del filtro hacia el interior del mismo.

Registrar el tiempo y la lectura del medidor de flujo al inicio. Permitir el flujo de un volumen aproximado de 380 L de agua.

Detener el flujo del agua en el dispositivo de muestreo cerrando la llave de la conexión para muestreo o en su caso apagando la motobomba.

Registrar el tiempo y la lectura del medidor de flujo al final.

Desconectar el dispositivo de la conexión para muestreo procurando mantener el extremo abierto de la conexión de entrada por encima del nivel del extremo abierto de la conexión de salida para prevenir posibles pérdidas de material particulado por retro lavado del filtro.

Una vez desconectado, drenar el agua que quedo en el dispositivo tanto como sea posible.

B.2.1.4.2 Preservación y transporte de la muestra

El cartucho filtrante contenido en el portacartucho puede ser llevado al laboratorio para su análisis dentro del portacartucho o fuera de él.

Para transportar el cartucho filtrante dentro del portacartucho, obstruir las conexiones de entrada y salida del portacartucho con el filtro dentro, etiquetando el portacartucho, en este caso no debe drenar el agua restante ya que será incorporada en los lavados posteriores durante la extracción del filtro en el laboratorio.

Para transportar el cartucho fuera del portacartuchos, abrir el dispositivo y asépticamente retirar el cartucho filtrante y colocarlo en una bolsa de plástico etiquetada, cerrar la bolsa, introducirla en una segunda bolsa y cerrar esta última bolsa.

En ambos casos, tanto el cartucho filtrante dentro del portacartuchos como el cartucho filtrante fuera del mismo, deberán ser refrigerados en la hielera con hielo o con geles congelantes tan pronto como sea posible después de realizado el muestreo.

En ningún caso debe congelarse la muestra y debe ser transportada al laboratorio de análisis para su procesamiento tan pronto como sea posible sin exceder de las 48 horas después de su colecta. Debe procurarse reducir al mínimo los tiempos de transporte y almacenamiento.

B.2.2 MÉTODO DE PURIFICACIÓN DE QUISTES DE Giardia lamblia  EN MUESTRAS DE AGUA PARA USO Y CONSUMO HUMANO

B.2.2.1 Símbolos y términos abreviados

g        gramos

Tween 80        monooleato de polioxietilen-sorbitano

v/v        volumen/volumen

B.2.2.2 Principio

Los quistes de Giardia lamblia concentrados a partir de una muestra de agua de gran volumen, y que se encuentran retenidos en el cartucho filtrante, deben ser extraídos para ser purificados; eliminando sedimento, detritus y demás materiales que interfieran con la identificación, determinación y cuantificación.

La purificación de los quistes se realiza generalmente a través de técnicas de flotación utilizando soluciones de sulfato de zinc (ZnSO4), sacarosa, citrato de potasio o Percoll-sacarosa.

B.2.2.3 Alcance y aplicación

Este método es utilizado en laboratorio para la extracción y purificación de los quistes de Giardia lamblia retenidos en el material filtrante a partir del flujo de una muestra de gran volumen de agua para uso y consumo humano durante el procedimiento de muestreo descrito en el punto B.2.1, de este Apéndice.

B.2.2.4 Equipos y materiales

Las referencias a marcas específicas y números de catálogo se incluyen sólo como ejemplos y no implican aprobación de los productos. Dicha referencia no excluye el uso de otros proveedores o fabricantes. Las referencias específicas pretenden representar especificaciones adecuadas para los artículos.

Botellas para centrífuga

Centrífuga capaz de alcanzar al menos 660 g y que permita procesar volúmenes de 3 a 4 L

Charola de Aluminio o acero inoxidable de 50 x 35 cm aprox. o papel aluminio

Guantes de nitrilo o látex

Mango para bisturí o una navaja afilada que permita un manejo aséptico

Micropipeta de volumen variable de 5-100 µL

Navajas para bisturí del tamaño adecuado

Puntas para micropipeta de 5-50 µL, 100 µL.

Sifón

Sistema de vacío con trampa (Matraz Kitasato de 4L; tapón de silicón; tubo de vidrio de 6mm de diámetro u otro adecuado; mangueras de plástico flexible; punta para micropipeta de 500-100 µL)

Tubos de centrífuga de 15 y 50 mL

Vaso de precipitados de polipropileno de 4 L

Vórtex

B.2.2.5 Reactivos y soluciones

Agua destilada grado reactivo

Formaldehído al 37% (v/v)

Disolución de formaldehído al 2% (v/v)

Tween 80 al 0.1%

B.2.2.6 Procedimiento

B.2.2.6.1 Liberación de quistes

Los quistes retenidos en el material del cartucho filtrante o en la membrana de filtración deben de ser extraídos antes del proceso de purificación para eliminar detritus y otros materiales retenidos en el cartucho filtrante que interfieran con la determinación de los quistes de Giardia lamblia.

En caso de que se entregue al laboratorio el portacartucho con el cartucho filtrante o membrana de filtración en su interior, deberá abrir el portacartuchos y retirar el material filtrante (cartucho filtrante o membrana de filtración) del portacartuchos vaciando el agua contenida en el portacartuchos dentro de un vaso de precipitados de 4 L.

En caso de que se entregue al laboratorio el cartucho filtrante o la membrana de filtración dentro de bolsas de muestreo, deberá abrir la bolsa secundaria y primaria para retirar el cartucho filtrante o la membrana de filtración. Las membranas o filtros utilizados deberán ser manipulados en condiciones asépticas utilizando guantes de nitrilo o látex.

En el caso de que se trate de cartuchos filtrantes, colocarlo sobre una charola de aluminio o acero inoxidable o sobre una hoja de papel aluminio.

Con la ayuda de un bisturí que permita un manejo aséptico, realizar cortes longitudinales a todo lo largo del cartucho y separar las fibras del filtro de la estructura central del cartucho.

Cortar las fibras en dos o más porciones aproximadamente iguales (incluir tanto la parte externa como la parte interna del filtro) y separar las fibras de cada porción tanto como sea posible. Es frecuente que se observe una clara diferencia entre la parte interna y externa de los filtros de acuerdo a la profundidad a la cual ha penetrado el sedimento en el cartucho del filtro. Alternativamente, localizar el final del hilo en el exterior del cartucho, desenrollar las fibras y dividir en porciones aproximadamente iguales.

Lavar cada porción por separado en vasos de precipitados de polipropileno de 4 L, con 1 L de agua destilada grado reactivo o con una disolución de Tween 80 al 0.1%. La muestra se agita y se presiona repetidamente durante 10 minutos procurando extraer todas las partículas que pudieran estar atrapadas entre las fibras. Para separar con más eficacia el material particulado, deberá amasar las fibras manualmente o agitarlas manual o mecánicamente durante 10 a 15 minutos, en este último caso agregando el volumen suficiente para cubrir las fibras. Exprimir cada porción y recoger todo el fluido combinándolo todo en un solo vaso, en su caso, en el mismo vaso de precipitados con el agua que estaba contenida en el portacartuchos. Si las fibras aun retienen cantidades significativas de material particulado repetir el proceso de extracción hasta que las fibras aparezcan limpias.

En caso de que se trate de membranas de filtración, deberá retirar la membrana del dispositivo de filtración y colocarla en 1 L de agua destilada grado reactivo o de una disolución de Tween 80 al 0.1%. La muestra se agita vigorosamente durante 10 minutos procurando extraer todas las partículas atrapadas en la superficie de la membrana.

El extracto obtenido puede ser sometido al procedimiento de concentración de quistes. Sin embargo, en caso de no poder continuar con el procedimiento el mismo día este puede preservar adicionando un volumen suficiente de formaldehido al 37% (v/v) para tener una concentración final de 2% (v/v). Refrigere este extracto preservado en un vaso de precipitados de 4 L o en botellas para centrifuga hasta continuar con el proceso de concentración al día siguiente.

B.2.2.6.2 Concentración de quistes

La refrigeración durante una noche, tanto en el vaso de precipitados como en las botellas para centrifuga, permitirá la sedimentación del extracto.

Si el extracto se refrigeró y sedimentó en el vaso de precipitados de 4 L durante toda la noche, deberá decantar o aspirar el sobrenadante con un sifón o un sistema de vacío con trampa.

Transferir el sedimento a un tubo de centrifuga del volumen apropiado (50 mL preferiblemente) y resuspenderlo en un volumen de formaldehido al 2% equivalente al volumen total del sedimento, en caso de que el sedimento sea escaso, resuspender en 10 mL de la disolución (utilice la mitad del volumen para resuspender y vaciar al tubo de centrífuga, y la mitad restante para lavar las paredes del recipiente donde se encontraba el sedimento). Puede ser necesario ocupar un poco más de disolución de formaldehido para los lavados. El extracto resultante está listo para ser centrifugado y continuar con el proceso de concentración de los quistes.

Si el extracto se refrigeró y sedimentó en botellas de centrifuga, estimar el volumen de los sedimentos y concentrar todos los sedimentos en un solo tubo de centrifuga (50 mL preferiblemente). De ser necesario utilizar un poco del volumen estimado de formaldehido al 2% para resuspender los sedimentos y vaciarlos y el resto para lavar las paredes de las botellas de centrífuga. Puede ser necesario ocupar un poco más de disolución de formaldehido para los lavados. El extracto resultante está listo para ser centrifugado y continuar con el proceso de concentración de los quistes.

Si el extracto no fue refrigerado ni sedimentado y es sometido al procedimiento de concentración de los quistes, está listo para ser centrifugado y continuar con el proceso de concentración de los quistes.

Centrifugar el extracto obtenido a 660 g durante 5 minutos. Decantar o aspirar el sobrenadante con ayuda de una micropipeta tanto como sea posible sin alterar o resuspender el sedimento.

Resuspender el sedimento en una disolución de formaldehído al 2%, transferirlo a un tubo para centrífuga de 15 mL y agitar con un vórtex. La cantidad de formaldehido adicionado deberá ser igual a la cantidad del sedimento obtenido.

Centrifugar a 660g durante 5 minutos. Decantar o aspirar el sobrenadante con ayuda de una micropipeta tanto como sea posible sin alterar o resuspender el sedimento. Si el sedimento obtenido es escaso, resuspender en 10 mL de la disolución de formaldehído al 2%, agitar con un vórtex y centrifugar a 600 g durante 5 minutos.

Si el volumen del sedimento es menor o igual a 1 mL, decantar o aspirar el sobrenadante en su totalidad y desechar el sobrenadante.

Si el volumen del sedimento es mayor a 1 mL resuspender en el sobrenadante y transferir volúmenes equivalentes de 1mL en tubos de centrifuga de 15 mL de capacidad, volver a centrifugar por 5 minutos a 660 g. Decantar y desechar el sobrenadante.

El volumen de sedimento restante en cada tupo debe ser de aproximadamente 1 a 2 mL.

B.2.3 MÉTODO MICROBIOLÓGICO PARA LA DETERMINACIÓN DE QUISTES DE Giardia lamblia EN MUESTRAS DE AGUA PARA USO Y CONSUMO HUMANO

B.2.3.1 Símbolos y términos abreviados

ZnSO4        sulfato de zinc

B.2.3.2 Principio

A partir de los quistes purificados puede realizarse la determinación de estos a través de observación microscópica usando cromógenos o técnicas de tinción con anticuerpos fluorescentes y criterios morfológicos.

B.2.3.3 Alcance y aplicación

Este método es utilizado para la determinación de quistes de Giardia lamblia, purificados a través del método descrito en el punto B.2.2, de este Apéndice, presentes en muestras de agua para uso y consumo humano colectadas al final del sistema de potabilización, a través de un método microbiológico por microscopia óptica con tinción con lugol.

De manera adicional a este método microbiológico por microscopia óptica con tinción con lugol, para la determinación de quistes de Giardia lamblia pueden utilizarse las técnicas de inmunofluorescencia (punto B.2.4, de este Apéndice) o de biología molecular (punto B.2.5, de este Apéndice) descritas en este método  de prueba.

B.2.3.4 Equipos y materiales

Las referencias a marcas específicas y números de catálogo se incluyen sólo como ejemplos y no implican aprobación de los productos. Dicha referencia no excluye el uso de otros proveedores o fabricantes.  Las referencias específicas pretenden representar especificaciones adecuadas para los artículos.

Aceite de inmersión

Asa bacteriológica estéril

Centrífuga capaz de alcanzar al menos 660 g y que permita procesar volúmenes de 3 a 4 L

Cubreobjetos de 24 x 50 mm, limpios y libres de grasa

Frascos con gotero de volumen adecuado

Micropipeta de volumen variable de 5-100 µL

Microscopio óptico de campo claro.

Palillo o aplicador de madera estéril

Portaobjetos de 25 x 75 mm, limpios y libres de grasa

Puntas para micropipeta de 5-50 µL, 100 µL.

Tubos de centrífuga de 15 y 50 mL

Vórtex

B.2.3.5 Reactivos y soluciones

Disolución de Lugol, la disolución madre consiste en 20 g de yodo metálico y 40 g de yoduro potásico, disueltos en un litro de agua destilada. Para preparar la disolución de trabajo diluya la disolución madre 1:5 con una disolución de ZnSO4 sulfato de zinc con una densidad de 1.20 (gramos por mililitro).

Disolución de Sulfato de Zinc con una densidad de 1.20 (gramos por mililitro) preparada a partir de ZnSO4 Sulfato de Zinc hepta hidratado, grado reactivo analítico

Vaselina sólida o algún sellador para muestras biológicas en portaobjetos

B.2.3.6 Procedimiento

B.2.3.6.1 Montaje de laminillas

Tomar el volumen de a 2 mL de sedimento resultante durante la concentración de los quistes realizada en el procedimiento de purificación (punto B.2.2, de este Apéndice).

Adicionar de 1 a 3 gotas de la disolución de trabajo de lugol 1:5 al sedimento y homogenizar manualmente con un palillo de madera estéril.

Agregar 5mL de la disolución de ZnSO4 de densidad 1.20 (gramos por mililitro), si utilizó un aplicador de madera, introducirlo en el tubo con el sedimento y el lugol al momento de agregar la disolución de sulfato de zinc (ZnSO4) para recuperar posibles pérdidas.

Mezclar de manera manual o con ayuda de un vortex y dejar reposar por 5 minutos.

Continuar adicionando la disolución de sulfato de zinc (ZnSO4) hasta la capacidad máxima del tubo, teniendo cuidado de evitar derrames.

Centrifugar por 3 minutos a 650 g. Abrir la tapa de la centrifuga con cuidado y sin tocar ni agitar los tubos dejar reposar de 2 a 5 minutos.

Los quistes de Giardia lamblia que se encontraban contenidos en la muestra de agua se encontrarán suspendidos en el sobrenadante formando, en la mayoría de los casos, una película flotante en la superficie del mismo.

Con la ayuda de un asa estéril recoger la película flotante en la superficie y colocarla en un portaobjetos rotulado, esta operación se puede repetir 2 o 3 veces para asegurar una mayor recuperación. Es necesario hacer laminillas hasta agotar la película flotante. El quiste está en la superficie no en el sedimento.

Colocar un cubreobjetos de 24 x 50 mm y selle la muestra con vaselina sólida o con algún otro sellador disponible. Los cubreobjetos y portaobjetos deberán manipularse cuidadosamente y por los bordes.

B.2.3.6.2 Observación microscópica

Las laminillas montadas en el apartado anterior, deben observarse bajo el microscopio óptico con el objetivo de 100X con aceite de inmersión, realizando un barrido total del cubreobjetos como se muestra en la Fig. B.2.3.-1, de este Apéndice.

Fig. B.2.3-1 Barrido de la muestra

La determinación de los quistes de Giardia lamblia deberá ser realizada por personal capacitado en esta actividad, teniendo cuidado de no confundir los quistes de Giardia lamblia con otros microorganismos como levaduras, diatomeas, Coccidias u otros organismos y siguiendo los siguientes criterios de inclusión:

       nitidez (pared del quiste bien definida)

       forma ovalada

       tamaño de 8 a 18µm de longitud

       estructura ovalada

       pared gruesa llamada pared quística que mide 0.3 a 0.5µm

       presencia de por lo menos dos de las siguientes características internas: presencia de núcleos (generalmente son cuatro y siempre aparecen dispuestos en alguno de los polos), cuerpos basales y axonemas.

El uso de microfotografías de quistes de Giardia lamblia obtenidas en referencias bibliográficas pueden ser de gran utilidad para la determinación de éstos.

B.2.3.6.3 Análisis de datos

Registrar las siguientes características:

       tamaño y forma del quiste

       presencia de núcleos

       presencia de cuerpos parabasales

       presencia de axonemas

Registrar el número de quistes de Giardia lamblia determinados en el total del sedimento, correspondiente al volumen de agua pasado a través del material filtrante (380 L) de acuerdo con el procedimiento de muestreo descrito (punto B.2.1, de este Apéndice).

B.2.3.7 Informe de prueba

Reportar ausencia o presencia de quistes de Giardia lamblia en el volumen total de la muestra filtrada.

B.2.3.8 Referencias

Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 9711.B Giardia lamblia. 18a Ed.1992.

B.2.4 TÉCNICAS DE INMUNOFLUORESCENCIA PARA LA DETERMINACIÓN DE QUISTES DE Giardia lamblia EN MUESTRAS FILTRADAS DE AGUA PARA USO Y CONSUMO HUMANO

De manera adicional al método microbiológico por microscopia óptica con tinción con lugol, para la determinación de quistes de Giardia lamblia pueden utilizarse las técnicas de inmunofluorescencia.

Las técnicas de inmunofluorescencia para la determinación de quistes de Giardia lamblia evolucionan rápidamente debido a los avances científicos y tecnológicos, por lo cual no se establece un método específico para la determinación de quistes de Giardia lamblia en el presente apartado.

Sin embargo, el usuario que utilice técnicas de inmunofluorescencia para la determinación de quistes de Giardia lamblia en muestras filtradas de agua y consumo humano posterior a la potabilización para el cumplimiento de esta Norma, deberá consultar la literatura actual y especializada para las técnicas y metodologías más recientes. Entre los métodos que pueden ser utilizados son los siguientes:

       EPA. 1995. ICR Protozoan Method for Detecting Giardia Cysts and Cryptosporidium Oocysts in Water by a Fluorescent Antibody Procedure

       EPA. 2005. Method 1623: Cryptosporidium and Giardia in Water by filtration/IMS/FA

La aplicación de técnicas de inmunofluorescencia es a menudo realizada a partir de kits disponibles comercialmente por ejemplo, entre otros, el kit EasyStainTM /BTF- A Biomerieux Company, por lo cual el usuario que utilice kits disponibles comercialmente para realizar técnicas de Inmunofluorescencia para la determinación de quistes de Giardia lamblia en muestras de agua y consumo humano posterior a la potabilización para el cumplimiento de esta Norma, debe de asegurarse que el kit utilizado incluya  cuando menos:

       Reactivo de inmunofluorescencia altamente específico para detectar la presencia de quistes de Giardia lamblia en muestras de agua

       Anticuerpos monoclonales IgGI altamente purificados para evitar reacciones cruzadas

       Control positivo en una concentración aproximada de 200 a 400 quistes por µl

       Aprobación de organismos internacionales como United States Environmental Protection Agency (Method EPA 1622/1623), United Kingdom Drinking Water Inspectorate o Japanese Water work Association

Las referencias a marcas específicas se incluyen sólo como ejemplos y no implican aprobación de los productos. Dicha referencia no excluye el uso de otros proveedores o fabricantes. Las referencias específicas pretenden únicamente representar especificaciones adecuadas para los artículos.

B.2.5 TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR PARA LA DETERMINACIÓN DE QUISTES DE Giardia lamblia EN MUESTRAS FILTRADAS DE AGUA PARA USO Y CONSUMO HUMANO

De manera adicional al método microbiológico por microscopia óptica con tinción con lugol, para la determinación de quistes de Giardia lamblia pueden utilizarse las técnicas de biología molecular.

Las técnicas de biología molecular para la determinación de quistes de Giardia lamblia evolucionan rápidamente debido a los avances científicos y tecnológicos, por lo cual no se establece un método específico para la determinación de quistes de Giardia lamblia en el presente punto.

Sin embargo, el usuario que utilice técnicas de biología molecular para la determinación de quistes de Giardia lamblia en muestras filtradas de agua y consumo humano posterior a la potabilización para el cumplimiento de esta Norma, deberá consultar la literatura actual y especializada para las técnicas y metodologías más recientes.

La aplicación de técnicas de biología molecular es a menudo realizada a partir de kits disponibles comercialmente por ejemplo, por lo cual para la determinación de quistes de Giardia lamblia en muestras filtradas de agua y consumo humano posterior a la potabilización por técnicas de biología molecular para el cumplimiento de esta Norma, se podrán utilizar kits de biología molecular como Kit TaqMan de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para Giardia lamblia, Kit Verde Fluorescente “SYBR Green” PCR para Giardia lamblia o Kit PCR punto final para Giardia lamblia o cualquier otro comercialmente disponible. Las referencias a marcas específicas se incluyen sólo como ejemplos y no implican aprobación de los productos. Dicha referencia no excluye el uso de otros proveedores o fabricantes, los cuales se recomienda que incluyan lo siguiente:

En el caso de kits TaqMan PCR para Giardia lamblia:

       Desoxinucleótidos trifosfatados (deoxyNTPs), Cloruro de magnesio (MgCl2), inhibidor de ribonucleasas (RNAsas), agua libre de RNAsas, polimerasa, amortiguador, fluoróforo pasivo o mezcla maestra (Master mix)

       control para la detección PCR, para monitorear la inhibición de la reacción y validar la calidad del proceso

       cebador de ácido desoxirribonucleido (DNA) (primer) o mezcla de Sondas (Probe mix) para la amplificación de una secuencia específica del genoma de Giardia lamblia

       control positivo y control negativo, para confirmar la integridad de los reactivos del kit

En el caso de kits SYBR Green qPCR para Giardia lamblia:

       deoxyNTPs, MgCl2, inhibidor de RNAsas, agua libre de RNAsas, polimerasa, amortiguador, fluoróforo pasivo o mezcla maestra (Master mix)

       cebadores de DNA (primers) para la amplificación de una secuencia específica del genoma de Giardia lamblia

       control positivo y control negativo, para confirmar la integridad de los reactivos del kit y un control interno para la validación de PCR

En el caso de kits PCR punto final para Giardia lamblia:

       deoxyNTPs, MgCl2, inhibidor de RNAsas, agua libre de RNAsas, polimerasa, amortiguador o mezcla maestra (Master mix)

       cebadores de DNA (primers) para la amplificación de una secuencia específica del genoma de Giardia lamblia

       control positivo y control negativo para confirmar la integridad de los reactivos del kit

       materiales necesarios para visualizar los segmentos amplificados del genoma de Giardia lamblia por electroforesis (buffer de carga, marcador de peso molecular, etc.)

Las referencias a marcas específicas se incluyen sólo como ejemplos y no implican aprobación de los productos. Dicha referencia no excluye el uso de otros proveedores o fabricantes. Las referencias específicas pretenden únicamente representar especificaciones adecuadas para los artículos.

B.3 MÉTODO PARA LA DETERMINACIÓN DE BTEX (BENCENO, TOLUENO, ETILBENCENO Y XILENOS) Y ESTIRENO EN AGUA PARA USO Y CONSUMO HUMANO POR CROMATOGRAFÍA DE GASES CON DETECTOR DE ESPECTROMETRÍA DE MASAS

B.3.1 Símbolos y términos abreviados

BFB        4-bromofluorobenceno

BTEX        benceno, tolueno, etilbenceno y xilenos (orto, meta y para)

CdC        curva de calibración

CG        cromatógrafo de gases

CG/EM        cromatografía de gases con detector de espectrometría de masas

DE        desviación estándar

EICP        perfil común de iones extraídos

EM        espectrometría de masas

EMIE        ionización de impacto electrónico

FR        factor de respuesta

FRR        factores de respuesta

m/z        masa/carga

PCIE        perfil de corriente de iones extraídos

PTFE        politetrafluoroetileno

R        coeficiente de correlación adimensional

%DER        desviación estándar relativa

B.3.2 Principio

Los compuestos orgánicos volátiles son transferidos eficientemente de la fase acuosa a la fase gaseosa mediante burbujeo de un gas inerte en la muestra. La fase gaseosa es arrastrada a través de una trampa en la cual se adsorben los analitos de interés. Al finalizar la purga, la trampa se calienta para desorber los compuestos y con el mismo gas inerte son introducidos en la columna cromatográfica. El cromatógrafo de gases se programa a una temperatura para separar los analitos de la muestra, los cuales son identificados y a su vez cuantificados por el espectrómetro de masas. La cuantificación se realiza comparando la respuesta de los iones característicos con una curva de calibración.

La identificación de los analitos de interés se logra comparando sus espectros de masas con los espectros de masas de estándares. La cuantificación se logra comparando la respuesta de un ion (cuantificación) con respecto a un estándar interno usando una curva de calibración apropiada para la aplicación deseada.

B.3.3 Alcance y aplicación

El método descrito es un procedimiento para la determinación de compuestos orgánicos volátiles, específicamente para benceno, tolueno, etilbenceno y xilenos (BTEX) así como estireno en muestras de agua de uso y consumo humano a través de cromatografía de gases con detector de espectrometría de masas (CG/EM). Existen varias técnicas mediante las cuales estos compuestos pueden introducirse en el sistema CG/EM, la técnica más común para analitos orgánicos volátiles es el método de purga y trampa.

B.3.4 Equipos y materiales

Las referencias a marcas específicas y números de catálogo se incluyen sólo como ejemplos y no implican aprobación de los productos. Dicha referencia no excluye el uso de otros proveedores o fabricantes. Las referencias específicas pretenden representar especificaciones adecuadas para los artículos.

Balanza analítica. Con sensibilidad de 0.1 mg.

Cámara de purga. Diseñada para aceptar muestras de 5 o 25 mL con una columna de agua de al menos 3 cm de profundidad. El espacio libre superior (headspace) gaseoso entre la columna de agua y la trampa debe tener un volumen total de al menos de 5 mL. El gas de purga debe pasar a través de la columna de agua en forma de burbujas finamente divididas con un diámetro menor de 3 mm. Introducir el gas de purga no más de 5 mm de la base de la columna de agua. El dispositivo de purga ilustrado en la Fig. B.3-1, de este Apéndice, cumple estos criterios. Se pueden utilizar otros tipos de dispositivos de purga siempre y cuando se demuestre que su desempeño es adecuado.

Fig. B.3-1 Dispositivo de purga. Se incluye sólo como ejemplo y no implican aprobación de los productos. Pretende únicamente representar especificaciones adecuadas para los artículos.

Columnas capilares: usar cualquier columna capilar de CG que cumpla con los criterios de desempeño. Asegurarse que el flujo del desorbente sea compatible con la columna elegida. Abajo se enlistan cuatro ejemplos de columnas aceptables.

Columna 1: de 60 m de longitud x 0.32 mm ID, con 1.5 µm de espesor de película, (Restek) RTX-volátiles o equivalente.

Columna 2: de 30 a 75 m de longitud x 0.53 mm ID, columna capilar recubierta con DB-624, con 3 µm de espesor de película o equivalente.

Columna 3: de 30 m de longitud x 0.25 a 0.32 mm ID, columna capilar recubierta con 95% de dimetil- 5 % de difenil polisiloxano, con 1 µm de espesor de película o equivalente.

Columna 4: de 60 m de longitud x 0.32 mm ID, columna capilar (Agilent-VOC), con 1.8 µm de espesor de película o equivalente.

Cromatógrafo de gases (CG) con detector de espectrometría de masas (EM). Utilizar un CG con temperatura programable adecuado para la inyección sin división (splitless), con división (Split) y con controladores de flujo. Utilizar un espectrómetro de masas (EM), capaz de escanear de 35 a 270 uma (unidad de masa atómica) cada segundo o menos, utilizando 70 eV de energía en modo de ionización de impacto electrónico (EMIE), debe ser capaz de producir un espectro de masas que cumpla con todos los criterios de la Tabla B.3-1, de este Apéndice, con 4-bromofluorobenceno (BFB).

Tabla B.3-1. Criterios de Abundancia (m/z) del BFB

Masa

Criterios de abundancia m/z

50

15 a 40 % de masa 95

75

30 a 60 % de masa 95

95

Pico base, de masa 95

96

5 a 9 % de masa 95

173

<2 % de masa 174

174

>50 % de masa 95

175

5 a 9 % de masa 174

176

95 a 101 % de masa 174

177

5 a 9 % de masa 176


Espátula de acero inoxidable

Envases con tapón de rosca recubierto con PTFE del volumen recomendado por el fabricante del sistema de purga y trampa.

Interface del CG/EM. Utilizar una interface de acoplamiento directo de la columna dentro del MS, las columnas generalmente utilizadas tienen un diámetro interno de 0.25 a 0.32 mm. Para columnas de 0.53 mm, utilizar un separador de jet, que incluye una línea de transferencia de todo el vidrio y dispositivo de vidrio de enriquecimiento o interface de división (Split). Esta interface es necesaria cuando se utiliza enfriamiento criogénico, la cual condensa los componentes desorbidos, sobre una banda estrecha de la pre-columna de sílice fundida no recubierta. Cuando la interface se calienta rápidamente, la muestra es transferida a la columna analítica capilar. Durante la etapa de crioconservación, la temperatura de la sílice fundida en  la interface se mantiene a -150 ºC bajo una corriente de nitrógeno líquido. Después del periodo de desorción, la interface debe ser capaz de calentarse rápidamente (en 15 s o menos) a 250° C para completar  la transferencia de los analitos.

Jeringas de 0.5, 1.0, 5, 10 y 25 mL de vidrio hipodérmico con punta Luer.

Jeringa con válvula de dos vías, con la terminación Luer, aplicable al dispositivo de purga

Materiales de empaque para la trampa. Se recomienda el empaque de metil silicona pero puede utilizarse otro tipo de empaque que tenga la capacidad de retener los compuestos de interés  (ver recomendaciones del fabricante.

Matraces volumétricos de vidrio con tapón esmerilado de 10, 50 y 100 mL verificados previamente.

Microjeringas de 10, 25, 100, 250, 500 y 1 000 µL

Sistema de datos. Conectar al espectrómetro de masas una computadora que permita la adquisición y almacenamiento de todas las masas del espectro obtenido a través del programa cromatográfico. El software debe permitir la búsqueda de todos los espectros adquiridos para las masas (m/z) de los iones específicos y graficar las abundancias de tales m/z en función del tiempo o número de barridos. Este tipo de gráfico es definido como el PCIE. El software también debe permitir la integración de las abundancias de cualquier PCIE sobre un tiempo específico o un límite de scan. Siendo necesaria la versión más reciente de biblioteca de espectros.

Sistema de purga y trampa o sistema de purga y trampa/headspace. El sistema de purga y trampa consiste en un dispositivo de purga, trampa y un desorbedor. Existen diferentes sistemas disponibles comercialmente.

Trampa. De al menos 25 cm de largo y con un diámetro interno de al menos 3 mm, empacado con las siguientes longitudes mínimas de adsorbentes: 1.0 cm de empaque de metil silicona, 7.7 cm del polímero 2,6-difenilo óxido, 7.7 cm de sílica gel y 7.7 cm de carbón de coco, o algún otra propuesta del proveedor que nos brinde la concentración de los volátiles esperados y cumplan con todos los criterios de calidad. Existen trampas de sorbentes disponibles comercialmente. Las especificaciones del ejemplo para la trampa se ilustran en la Fig. B.3-2.

Fig. B.3-2. Especificaciones del ejemplo de trampa

Válvulas de jeringa, bilateral, con punta desechable.

Vaso de precipitados de 100 mL de vidrio.

Viales de 40 mL con tapón de rosca recubierto con PTFE o Teflón

B.3.5 Reactivos y soluciones

Ácido clorhídrico, HCl. Grado reactivo que cumpla las especificaciones de la American Chemical Society (ACS) o equivalente. Libre de compuestos orgánicos volátiles y bajo condiciones de aseguramiento de los volátiles presentes en las muestras.

Ácido clorhídrico 1:1 v/v. Adicionar cuidadosamente un volumen medido de HCl a un volumen igual de agua libre de compuestos orgánicos.

Agua Tipo I. Agua libre de compuestos orgánicos.

Carbón de coco Pasado a través de malla 26 (Material del empaque de la trampa).

Clorobenceno d5 (Estándar interno).

Empaque de metil-silicona-OV-1 (3%) En chromosorb-W, con malla 60/80 o equivalente (Material del empaque de la trampa).

Estándares de Control de Calidad

Gas inerte de alta pureza

Materiales de referencia. Certificado (trazables) para benceno, tolueno, etilbenceno, Xilenos (orto, meta y para) y estireno.

Metanol CH3OH. Libre de compuestos orgánicos

Nitrógeno líquido (en caso necesario)

Polímero 2,6-difenilo óxido. De malla 60/80, grado cromatográfico (Material del empaque de la trampa).

Sílica gel. De malla 35/60, grado 15 o equivalente (Material del empaque de la trampa).

Tolueno d8 (Estándar surrogado)

1,4 difluorobenceno d4 (Estándar interno)

4-bromofluorobenceno (Estándar surrogado)

1,2-dichloroethane-d4 (Estándar surrogado).

Otros compuestos pueden ser usados como surrogados, mientras se demuestre su desempeño.

B.3.6 Procedimiento

B.3.6.1 Preparación de diluciones estándar

B.3.6.1.1 Para preparar las disoluciones estándar concentradas de benceno, tolueno, etilbenceno, xilenos (orto, meta y para) y estireno, se debe preparar a partir de materiales estándar puros o de disoluciones certificadas. Preparar las disoluciones estándar en metanol. Colocar aproximadamente 9.8 mL de metanol en un matraz volumétrico de 10 mL que ha sido tarado incluyendo el tapón. Dejar reposar el matraz sin tapar, durante unos 10 minutos o hasta que todos las superficies humedecidas con alcohol se hayan secado. Pesar el matraz con una precisión de 0.1 mg.

Adicionar los materiales de referencia usando una jeringa de 100 µL o una pipeta de vidrio con punta capilar desechable, inmediatamente adicionar dos o más gotas del material de referencia en el matraz. Asegurarse de que las gotas caigan directamente en el alcohol sin tocar el cuello del matraz. Después volver a pesar el matraz, llevar a volumen, tapar y agitar invirtiéndolo varias veces. Calcular la concentración en µg/L de ganancia neta en el pesaje.

Cuando la pureza de un compuesto es 96%, calcular la concentración de la disolución sin considerar la pureza para el cálculo. Preferentemente usar estándares preparados comercialmente certificados por el fabricante o una fuente independiente.

Transferir la disolución estándar a un envase con tapón de rosca recubierto con PTFE. Almacenar con un mínimo espacio de cabeza (headspace) y protegido de la luz a una temperatura 6 °C.

B.3.6.1.2 Para preparar las disoluciones estándares de trabajo de benceno, tolueno, etilbenceno, xilenos (orto, meta y para) y estireno, a partir de las disoluciones de estándares concentradas, preparar disoluciones multicomponentes en metanol a una concentración adecuada, almacenar con un mínimo de espacio de cabeza, y revisada frecuentemente por signos de degradación o evaporación. Siendo necesario reemplazarlos después de 2 a 4 semanas a menos que se tenga documentada el funcionamiento adecuado del mismo. Si se trabaja con soluciones de mezclas certificadas, se pueden almacenar de acuerdo a las indicaciones del proveedor. Para la preparación de está disolución metanólica no utilizar un volumen menor de 10 µL.

B.3.6.1.3 Para preparar las disoluciones estándares de trabajo del surrogado/ estándar interno, los compuestos surrogados recomendados son: tolueno d8, 4-bromofluorobenceno y 1,2- dicloroetano-d4, pueden utilizarse otros compuestos dependiendo de los requerimientos del análisis y de los analitos que se requieren cuantificar. Es necesario preparar una solución madre y de ella la solución apropiada para adicionar. Cada muestra que se va analizar debe contener los subrogados.

Los estándares internos recomendados son el fluorobenceno, clorobenceno-d5 y el 1,4-diclorobenceno-d4, se pueden utilizar otros compuestos siempre y cuando tengan tiempos de retención similares a los analitos detectados. Es necesario preparar una solución madre y de ella la solución apropiada para adicionar. Se recomienda una solución de 25 mg/L de cada estándar interno, de modo que la adición de 10 µL a una muestra de 5 mL sería equivalente a 50 µg/L. Si se emplea un espectrómetro de masas más sensible se puede emplear una solución de estándares internos más diluida. Las áreas de los estándares internos deberán están entre 50 y 200% de las áreas de los analitos en los puntos medios de las curvas de calibración.

B.3.6.1.4 Para preparar el estándar de BFB, preparar una solución de estándar conteniendo 25 ng/µL de BFB en metanol, si se emplea un espectrómetro de masas más sensible, se puede emplear una solución más diluida.

B.3.6.1.5 Para las disoluciones acuosas de los estándares de calibración, se debe de construir una curva de calibración para cada analito (BTEX y estireno) de cinco a siete concentraciones. La disolución estándar de menor concentración deberá ser mayor al límite de detección pero muy cercano.

Preparar cada una de las mezclas de disoluciones estándar de la curva de calibración inyectando rápidamente el volumen requerido de la disolución estándar metanólica (mezcla de estándares de BTEX y estireno, en el matraz volumétrico previamente lleno con agua libre de compuestos orgánicos, sumergiendo la aguja dentro del agua, se recomienda inclinar el matraz mientras se inyecta la mezcla de estándares. Posteriormente adicionar a cada matraz las soluciones de estándar interno y estándar surrogado.

B.3.6.2 Procedimiento analítico

Para la optimización del CG/EM, las condiciones cromatográficas dependen de los compuestos de interés, el instrumento y los proveedores de las columnas.

Las condiciones cromatográficas recomendadas para inyección directa (ejemplo) son:

Temperatura de inyector: 200-275 °C

Temperatura de la línea de transferencia: 200-300 °C

Columna cromatográfica: DB-624 (6%cianopropilfenil/94%dimetipolisiloxano) de 70 m X 0.53 mm o cualquier columna equivalente que proporcione un desempeño de método que permita cumplir con las especificaciones de esta Norma.

Flujo de gas acarreador 4 ml/min

Programación de condiciones: temperatura inicial 40 °C durante 3 minutos, 8 °C/minuto hasta 260 °C, hasta que todos los compuestos esperados hayan eluido.

Bake column durante 75 minutos.

De manera general las condiciones de análisis estarán en función de los equipos e instrumento utilizado para la determinación (éstos incluye cromatógrafo, detector, columna cromatográfica, etc.).

El espectrómetro de masas requiere un ajuste adicional, sintonizando de tal manera que al comienzo de cada periodo de 12 horas de análisis y antes del análisis de blancos, estándares y muestras verificar el sistema CG/EM inyectando 25 ng de 4-bromofluorobenceno (BFB) directamente en la columna del cromatógrafo. Si se dificulta la inyección directa, adicionar 1 µL de disolución de BFB de 25 µg/mL a 25 mL de agua en una jeringa utilizada para transferir muestras para dispositivos de purga y analizar como una muestra. Se debe de obtener un espectro de masas de corrección de fondo y confirmar que se cumplen los criterios de abundancia m/z descritos en la Tabla B.3-1. Si no se cumplen todos los criterios, repetir la prueba hasta que se cumplan todos.

En relación con el procedimiento de purga y trampa, es necesario llevar a cabo el análisis para la purga y concentración de los analitos a temperatura ambiente. Es necesario que los estándares de calibración, muestras y muestras control de calidad sean purgadas a la misma temperatura. Purgar la muestra con helio u otro gas inerte a un flujo entre 20 y 40 mL/minuto durante 11 minutos.

Llevar a cabo la desorción utilizando una temperatura de 245 °C con un flujo de 10 mL/min y una duración de 1.5 minutos o de acuerdo a las condiciones establecidas durante la optimización del método. Después de la desorción de la muestra reacondicionar la trampa reiniciando el ciclo de purga y manteniendo la temperatura de la trampa a 245 °C durante 10 minutos.

Proceder de igual manera con los blancos, curva de calibración y muestras de control de calidad.

De manera general las condiciones de análisis estarán en función del equipo utilizado para la determinación (sistema de purga y trampa y trampa utilizada).

B.3.6.3 Análisis de la muestra

Las muestras deben almacenarse en viales con tapa con un espacio mínimo de cabeza, a 4 °C o menos y en un área libre de disolventes orgánicos. El tamaño de alguna burbuja formada durante el enfriamiento de la muestra no debe ser mayor de 5-6 mm, cuando se observe alguna burbuja en el vial se debe revisar que éste no presente fuga, de ser así la muestra debe descartarse. Todas las muestras deben analizarse tan pronto como sea posible, después de haber sido recolectadas, generalmente en un máximo de 14 días después  de la recolección.

Poner a temperatura ambiente la muestra y transferir 5mL al dispositivo de purga utilizando el automuestreador, o manualmente utilizando una jeringa. Si los volúmenes de muestra son mayores de 5 mL, por ejemplo muestras de 25 mL, entonces los volúmenes de los estándares de calibración deben  ser los mismos.

Para tomar la alícuota de la muestra que será inyectada en el sistema de purga en forma manual, utilizar una jeringa con válvula de cierre. Retirar el émbolo de la jeringa y cerrar la válvula. Abrir el envase de la muestra y cuidadosamente colocar la muestra dentro del cuerpo de la jeringa. Colocar nuevamente el émbolo de la jeringa y antes de presionar el émbolo, invertir la jeringa y abrir la válvula, posteriormente presionar el émbolo para eliminar el aire y ajustar el volumen de la muestra a 5 ó 25 mL según sea el caso.

Si hay muestra suficiente disponible, utilizar otra jeringa para tomar una segunda alícuota, para su análisis por duplicado (una vez que la tapa de la muestra se ha removido, la muestra no se puede almacenar, debido al espacio de cabeza (headspace).

Adicionar una cantidad apropiada de la mezcla de los estándares surrogados y estándar interno a través del orificio de la válvula y cerrarla. Unir con el dispositivo de purga, abrir las válvulas e inyectar la muestra en el recipiente de purga. Cerrar las válvulas y purgar la muestra por 11 minutos a temperatura ambiente a un flujo de 40 mL/min (helio o nitrógeno). Si el vapor de agua causa problemas en el espectrómetro de masas, utilizar una purga seca de 3 minutos y/o un módulo de control de humedad.

Absorber los materiales atrapados en la cabeza de la columna cromatográfica a 180 °C mientras pasa el gas inerte a un flujo compatible con la columna de elección y comenzar un programa de temperatura  en el CG.

Establecer el sistema de auto-drenaje para la cámara de purga vacío mientras la trampa está siendo absorbida dentro del CG, o alternativamente, utilizar una jeringa de muestra para vaciar el recipiente. Lavar la cámara con dos enjuagues de 25 mL de agua si las muestras que se están analizando están altamente contaminadas. Asegurarse que todas las áreas humedecidas durante la purga están también humedecidas durante el enjuague para maximizar el enjuague.

Reacondicionar la trampa en el horno a la temperatura de acuerdo a lo que recomienda el fabricante por 5 a 7 minutos. Dejar que la trampa se enfríe a temperatura ambiente antes de introducir la siguiente muestra en el recipiente de purga. Cuando todos los compuestos de la muestra han sido eluidos de la columna cromatográfica, terminar la adquisición de datos y guardar los archivos. Usar un software que muestre el intervalo completo de los espectros de masas y un apropiado EICP. Si la abundancia de un ion excede el sistema del intervalo de trabajo, diluir la muestra en una segunda jeringa con agua y analizar.

Tener cuidado con la muestra porque los compuestos pueden ser volátiles y se pueden perder si se reabre la muestra. Estimar la dilución necesaria y expulsar el exceso de muestra de la segunda jeringa, inyectar esa porción en un recipiente de purga y con una segunda jeringa, adicionar el agua necesaria para tener un total de 25 mL en el recipiente de purga.

B.3.6.4 Análisis de datos y cálculos

Una vez que se han identificado los compuestos, la cuantificación de estos compuestos debe basarse en la abundancia del área integrada del ion característico primario (PCIE). El patrón interno utilizado debe ser el más cercano al tiempo de retención del analito de interés.

El software de la estación de trabajo genera un reporte de cuantificación con respecto a la curva de calibración. Dicho informe contiene los valores de áreas, tiempo de retención y concentración de los estándares internos y surrogados.

El analista es responsable de asegurar que la integración sea correcta, ya sea si es realizado por el software o manualmente. El analista debe buscar minimizar la integración manteniendo adecuadamente el instrumento, actualizando los tiempos de retención y configurando los parámetros de integración del pico.

El cálculo se realiza utilizando la ecuación de la recta y con la técnica del estándar interno, de acuerdo a la siguiente fórmula:

Dónde:

Xs = Masa calculada del Analito o surrogado en la alícuota de muestra introducida en el instrumento

As = Respuesta analítica del analito o surrogado en la muestra

Ais = Respuesta analítica del estándar interno en la muestra introducida en el instrumento

Cis = Masa del estándar interno en la alícuota de la muestra introducida en el instrumento

a = Intercepto de la ecuación de la recta de la curva de calibración

b = Pendiente de la ecuación de la recta de la curva de calibración

Promediar el resultado de la muestra y su duplicado

Anexar las evidencias instrumentales junto con el informe (cromatogramas y espectros de masas) de los compuestos detectados.

B.3.6.5 Informe de prueba

Reportar cada uno de los compuestos (benceno, tolueno, o-xileno, meta-xileno, para-xileno y estireno) en µg/L.

B.3.7 Control de calidad, calibración e interferencias

B.3.7.1 Control de calidad

Antes del análisis de las muestras leer un blanco para demostrar que todas las partes del equipo en contacto con la muestra y los reactivos están libres de interferencias.

Los blancos de reactivos, blancos de almacenamiento, muestras fortificadas y duplicados deben someterse a los mismos procedimientos analíticos que los utilizados en las muestras.

El laboratorio debe demostrar la competencia inicial y mantener los registros de esto.

Durante el análisis de rutina, se deben analizar blancos de reactivos, blancos de almacenamiento, muestras fortificadas y duplicados de muestras. Se deben agregar surrogados a las muestras y a la muestras de control de calidad.

Siempre que sea posible, el laboratorio debe analizar materiales de referencia certificados y participar en estudios de pruebas de aptitud.

El laboratorio debe tener procedimientos de control de calidad para asegurarse de que la integridad de la muestra no se vea comprometida durante el proceso de recolección y manipulación de las muestras, por ejemplo, asegurándose que las tapas y septas de los viales no presenten fugas.

El espectrómetro de masas se calibra con el estándar de BFB ajustando masas e intensidad de los iones. Los tiempos de retención relativos de los analitos en la muestra deben estar dentro de ± 0.06 unidades de tiempo de retención de los estándares.

La intensidad relativa de los iones característicos de cada uno de los compuestos en la muestra debe encontrarse dentro del 30% de las intensidades relativas de estos iones en el espectro de los estándares de referencia (ejemplo: para un ion con abundancia del 50% en el espectro de referencia, la abundancia en el espectro de la muestra debe encontrarse en el intervalo de 20% al 80%).

La curva de calibración inicial para cada compuesto de interés debe verificarse cada 12 horas, analizando un estándar de calibración de concentración cercana al punto medio del intervalo de la curva de calibración (CdC). Si el %DSR de los factores de respuesta es menor o igual al 20%, la calibración inicial continúa vigente, si el valor es mayor que 20% para cualquier CdC, revisar la preparación del estándar, las condiciones instrumentales, si el problema continúa preparar una nueva curva y recalibrar.

Analizar un blanco de reactivos después de analizar el estándar de calibración o intermedio en el lote analítico, para asegurar que el sistema está libre de contaminación.

B.3.7.2 Calibración

B.3.7.2.1 Preparar una curva de calibración de al menos cinco niveles de concentración conteniendo las concentraciones requeridas de estándares (BTEX y estireno) de calibración, incluyendo subrogados y/o estándares internos, y transferir 5 ó 25 mL (según se requiera) al dispositivo de purga utilizando el automuestreador, o manualmente utilizando una jeringa. Si los volúmenes de muestra son mayores de 5 mL, por ejemplo muestras de 25 mL, entonces los volúmenes de los estándares de calibración deben  ser los mismos.

El cálculo de regresión debe generar un coeficiente de correlación (r) mayor o igual a 0.99.

B.3.7.2.2 Procedimiento de calibración con estándar externo

Emplear este procedimiento solo si el volumen de la inyección puede mantenerse constante.

Analizar cada concentración de la curva de calibración. Calcular individualmente los factores de respuesta (FR) para cada estándar analizado de la siguiente manera:

Calcular la cantidad de compuesto para cada estándar:

En donde:

WS        cantidad del compuesto, µg

VS        volumen del estándar extraído, L

CS        concentración del estándar preparado en µg/L

Para cada componente determinar el promedio del factor de respuesta (FR) y la desviación estándar de los factores de respuesta empleando todos los estándares de calibración analizados. Si el porciento de la desviación estándar relativa (%DER) es menos del 20%, se puede emplear el FR promedio para calcular la concentración de la muestra:

En donde:

DE        desviación estándar

FR        factor de respuesta

Si el %DER es mayor del 20 %, graficar la curva de calibración de cantidad inyectada contra respuesta, emplear la gráfica para determinar la cantidad del componente presente en cada muestra. Después determinar la concentración dividiendo la cantidad, µg, por el volumen en L, de muestra extraída. Opcionalmente emplear el sistema de datos para realizar una regresión lineal y emplear la ecuación para calcular la cantidad de los componentes a partir de los valores de respuesta.

Cuando se emplee el valor promedio del FR, calcular la concentración como sigue:

En donde:

CX        concentración del compuesto en mg/L

RX        respuesta de la muestra (mm, área, etc.)

VX        volumen de la muestra extraída en L

B.3.7.2.3 Procedimiento de calibración con estándar interno.

Emplear este procedimiento cuando el volumen de la inyección no se mantiene constante.

Los estándares internos deben ser los más cercanos a los analitos a cuantificar de modo que tengan tiempos de retención relativos de 0.80 1.20. Usar el ion del pico base de estándar interno específico como ion primario para la cuantificación. Si se presentan interferencias utilice el siguiente ion de mayor intensidad para la cuantificación.

Elaborar una lista con las áreas de los iones característicos (Tabla B.3-1, de este Apéndice), contra la concentración de cada compuesto y estándar interno.

Calcular los FRR para cada compuesto relativo a cada uno de los estándares internos.

Tabla B.3-1. Iones característicos de los compuestos

Compuesto

Ion primario

Ion secundario

Benceno

78

--

Etilbenceno

91

106

Tolueno

92

91

Xilenos (orto, meta y para)

106

91

Estireno

104

78


Analizar cada concentración de la curva de calibración. Para todos los análisis hechos en una secuencia analítica, determinar el promedio y la desviación estándar de la respuesta del estándar interno. Calcular el porciento de la desviación estándar relativa (%DER), si el %DER es mayor del 20%, tomar acciones correctivas para mejorar la precisión del método. Establecer un intervalo de confianza de 99% para la respuesta del estándar interno usando el promedio calculado y la desviación estándar del análisis de la muestras. Rechazar los análisis cuando la respuesta del estándar interno está fuera de los límites y volver a analizar. Después del análisis de los estándares de calibración, calcular los factores de respuesta relativos (FRR) individuales de cada analito en cada estándar de la siguiente manera:

En donde:

Rs, Ri        respuestas del estándar de calibración y del estándar interno respectivamente.

Cs, Ci        concentraciones del analito en los estándares de calibración y del estándar interno respectivamente.

Calcular el promedio de los FRR de cada analito, las desviaciones estándar de los FRR y %DER. Si él %DER es menor del 20%, utilizar el valor promedio del FRR; si es mayor, graficar la curva de calibración o la ecuación de regresión lineal como se describe en el procedimiento de estándar externo.

Cuando se utilice el promedio de los FRR del estándar interno, calcular la concentración de las muestras con la ecuación siguiente:

En donde:

Cx        concentración del analito en la muestra en mg/L

Rx        respuesta de la muestra

Ci        concentración del estándar interno

Ri        respuesta del estándar interno

B.3.7.3 Interferencias

Las interferencias introducidas por las muestras son contaminantes que son co-extraídos de ellas por lo que la cantidad de éstas varía dependiendo del tipo de muestra y su naturaleza.

Las interferencias del método pueden originarse por la presencia de contaminantes en el material de vidrio o en el sistema de purga y trampa que puede conducir a obtener picos distorsionados y picos fantasma y/o línea base elevada en el cromatograma. El blanco electrónico (inyección de aire) permite verificar el grado de contaminación del sistema.

Tomar en consideración las impurezas en el gas de purga y compuestos orgánicos de desgasificación. También puede ser ocasionada por la contaminación del equipo y de la tubería de la trampa. Demostrar que el sistema está libre de contaminación bajo condiciones de operación analizando los blancos de  reactivos diariamente.

Utilizar blancos sólo para monitorear; son inaceptables las correcciones por valores de blancos. En el sistema de purga y trampa evitar usar tubería de plástico y selladores de rosca que no sean de PTFE, o controladores de flujo con componentes de caucho. Asegurarse que el área analítica no es fuente de contaminación por disolventes de laboratorio.

Utilizar un blanco de reactivos preparado a partir de agua y llevado a través de la toma de muestras, manipulación y procedimientos de envío como un control de este tipo de contaminación.

La contaminación por arrastre puede ocurrir siempre que se analiza una muestra con concentraciones altas del o los analitos e inmediatamente después se analiza una muestra con concentraciones bajas. Para reducir el arrastre enjuagar el dispositivo de purga y la jeringa de inyección de muestra con agua entre muestra y muestra. Después del análisis de una muestra de concentración alta, analizar un blanco de reactivos para verificar que esté libre de contaminación. Para muestras que contienen cantidades de materiales solubles en agua, sólidos suspendidos, compuestos con alto punto de ebullición o altos niveles de compuestos volátiles, entre análisis lavar la cámara de purga con una solución detergente, enjuagar con agua destilada y secar en un horno a 105 °C. La trampa y otras partes del sistema también son objeto de contaminación, por lo tanto frecuentemente purgar todo el sistema.

B.3.8 Seguridad

La toxicidad o carcinogenicidad de todos los reactivos no se han determinado con precisión. Sin embargo, todas las sustancias deben ser tratadas como potencial peligroso para la salud, por lo que al manipular las disoluciones estándar, los analistas deberán realizarlo en campana y utilizar respiradores con filtros especiales para gases tóxicos además del vestuario básico (bata y guantes). Estos materiales estándar puros y las disoluciones preparadas deberán almacenarse en condiciones recomendadas por el proveedor.

B.3.9 Referencias

EPA Method 8260c Volatile Organic Compounds by gas Chromatography/mass Spectrometry (GC/MS)

EPA Method 5030c Purge and Trap for Aqueous Samples.

B.4 MÉTODO DE PRUEBA PARA LA DETERMINACIÓN DE PLATA TOTAL Y ALUMINIO  EN AGUA PARA USO Y CONSUMO HUMANO

Para la determinación de plata total y aluminio para el cumplimiento de esta Norma, se podrá utilizar indistintamente el método de prueba para la determinación de plata total y aluminio en agua para uso y consumo humano por espectrometría de absorción atómica con horno de grafito (punto B.4.1, de este Apéndice) o el método de prueba para la determinación de aluminio, antimonio, arsénico, bario, cadmio, cobre, cromo, fierro, manganeso, níquel, plata, plomo y selenio por espectrometría de emisión óptica de plasma acoplado inductivamente (ICP-OES). (punto B.4.2, de este Apéndice).

B.4.1 MÉTODO DE PRUEBA PARA LA DETERMINACIÓN DE PLATA TOTAL Y ALUMINIO EN AGUA PARA USO Y CONSUMO HUMANO POR ESPECTROMETRÍA DE ABSORCIÓN ATÓMICA  CON HORNO DE GRAFITO

B.4.1.1 Símbolos y términos abreviados

Ag        plata

Al        aluminio

HCl        ácido clorhídrico

LCH        lámpara de cátodo hueco

LDE        lámpara de descarga sin electrodos

PTFE        politetrafluoroetileno

B.4.1.2 Principio

Las muestras de agua se conservan mediante tratamiento con ácido y se digieren si es necesario. Una pequeña submuestra se inyecta en el horno de grafito del espectrómetro de absorción atómica. El horno se calienta eléctricamente. Al aumentar la temperatura gradualmente, la muestra se seca, se piroliza y se atomiza.

La espectrometría de absorción atómica se basa en la capacidad de los átomos para absorber la luz a una longitud de onda específica para cada elemento. Cuando el haz de luz pasa a través de la nube de átomos, ésta es absorbida selectivamente.

La concentración de un elemento en una muestra se determina comparando la absorbancia de la muestra con la absorbancia de disoluciones de calibración.

B.4.1.3 Alcance y aplicación

El método descrito es un procedimiento para la determinación de niveles trazas de plata total (Ag) y aluminio (Al) en agua de uso y consumo humano proveniente de sistemas de abastecimiento utilizando la espectrometría de absorción atómica con atomización electrotérmica en horno de grafito.

Este método es aplicable también para la determinación de bajas concentraciones de Arsénico (As), Cadmio (Cd), Cobalto (Co), Cromo (Cr), Cobre (Cu), Fierro (Fe), Manganeso (Mn), Molibdeno (Mo), Níquel (Ni), Plomo (Pb), Antimonio (Sb), Selenio (Se), Talio (Tl), Vanadio (V) y Zinc, para agua de uso y consumo humano proveniente de sistemas de abastecimiento, así como para agua superficial y subterránea, sin embargo, este documento se refiere exclusivamente para la determinación de plata total y aluminio en agua de uso y consumo humano proveniente de sistemas de abastecimiento, por lo que para la determinación de otros elementos y en otras matrices deberán de realizarse las adecuaciones necesarias.

B.4.1.4 Equipos y materiales

Las referencias a marcas específicas y números de catálogo se incluyen sólo como ejemplos y no implican aprobación de los productos. Dicha referencia no excluye el uso de otros proveedores o fabricantes. Las referencias específicas pretenden representar especificaciones adecuadas para los artículos.

El límite de detección depende de la matriz de la muestra así como del equipo, el tipo de atomizador y el uso de modificadores químicos. Para muestras de agua con una matriz simple (concentración baja de sólidos y partículas disueltas), los límites de detección del método estarán cerca de los límites de detección del equipo.

Balanza analítica. Con sensibilidad de 0.1mg

Centrífuga de laboratorio. Capaz de mantener 1600 rpm

Embudos de filtración. De diferentes capacidades: de polietileno, polipropileno, PTFE o vidrio.

Espectrómetro de absorción atómica con horno de grafito. Equipado con sistema de corrección de fondo y automuestreador.

Filtros. Con tamaño de poro de 0.45 µm

Fuente de radiofrecuencia. En caso de usar LDE.

Horno de microondas. O sistema de reflujo o sistema de digestión abierto.

Lámpara. De cátodo hueco (LCH) y/o Lámpara multi-elemento y/o lámpara de descarga sin electrodos (LDE) de plata.

Material común de laboratorio.

Matraces volumétricos. De diferentes capacidades.

Papel filtro. De filtración media # 1, 2, 111, 43, 41, 40 etc.

Pipetas de pistón (micropipetas). De diferentes capacidades.

Puntas de plástico. Para pipetas de pistón.

Recipientes. De polipropileno o PTFE.

Sistema de extracción. Para eliminar el humo y los vapores que son peligrosos para la salud del analista.

Tubos de grafito. Cubiertos pirolíticamente

Viales

B.4.1.5 Reactivos y soluciones

Ácido nítrico (HNO3). Grado reactivo (G.R)

Ácido nítrico de alta pureza (HNO3). Al 65% v/v (con contenido de metales en niveles traza).

Agua tipo I.

Argón o nitrógeno. De alta pureza grado absorción atómica.

Disolución de ácido nítrico. Grado reactivo al 10% (Para la descontaminación del material). Por cada litro a preparar, agregar 100 mL de ácido de la siguiente manera: en un recipiente que contenga aproximadamente 2/3 partes de agua agregar la cantidad de ácido requerida y llevar al volumen total  con agua.

Disolución de nitrato de Magnesio hexahidratado [Mg (NO3)2•6H2O)]. De alta pureza (con contenido de metales a niveles traza).

Disolución estándar de plata o aluminio. De 1000 mg/L de preferencia trazable a patrones nacionales o internacionales. La disolución puede prepararse a partir de la sal, y debe tener una pureza >99.95%. La sal debe ser secada por 1 h a 105 °C.

Disolución de paladio (Pd). Con niveles traza de metales (de alta pureza).

Fosfato de amonio monobásico (NH4H2PO4). Con niveles traza de metales (de alta pureza).

B.4.1.6 Procedimiento

B.4.1.6.1 Lavado de material

Todo el material utilizado debe someterse a lavado de acuerdo con las siguientes instrucciones:

El jabón que se use debe ser neutro de preferencia líquido.

Enjuagar perfectamente con agua corriente.

Sumergir el material de vidrio o plástico en un recipiente (de preferencia de plástico) que contenga una solución de ácido nítrico al 10%. El HCl es más efectivo para el lavado de material de polietileno o polipropileno, mientras que el HNO3 es preferible para el material de PTFE o de vidrio.

Dejarlo tapado y reposando por un lapso mínimo de 2 horas.

Quitar el exceso de ácido nítrico con varios enjuagues de agua de red y el último enjuague con agua tipo I.

Dejar escurrir y secar.

Tapar con papel parafinado o en bolsas cerradas de plástico.

Guardar en cuanto esté seco para evitar contaminación por partículas en el aire.

B.4.1.6.2 Preparación de las muestras

Las muestras se pueden analizar directamente por espectrometría de absorción atómica sin realizar la digestión si son inodoras, incoloras y transparentes.

Previo al análisis adicionar a 100 mL de muestra, 1 mL de ácido nítrico de ultra alta pureza. En caso que se observe un precipitado, este volumen de muestra se digiere adicionando 1 mL más de ácido nítrico de ultra alta pureza concentrado, calentar a 85°C hasta reducir el volumen a 20 mL cuidando que no hierva.

En caso de que el precipitado sea considerable se sugiere la adición de 10 mL de ácido nítrico de ultra alta pureza para realizar la digestión de la muestra.

Calentar a reflujo por 20 min y transferir a un matraz volumétrico de 50 mL.

Llevar al volumen con agua tipo I

Centrifugar a 1600 rpm por 30 minutos o dejar reposar toda la noche y analizar el sobrenadante.

Se puede utilizar el horno de microondas para digerir las muestras si se forma un precipitado al adicionar el ácido nítrico. Proceder de acuerdo a las condiciones recomendadas por el fabricante.

Preparar un blanco de reactivos fortificado por cada lote, analizar una muestra por duplicado y una muestra fortificada por cada 10 muestras o por grupo si son menos.

B.4.1.6.3 Preparación de diluciones y curvas de calibración

Para la preparación de las disoluciones madre (más concentradas). Medir un volumen apropiado de disolución estándar (aprox. 1 a 10 mL) para el aforo inicial, y hacer las diluciones necesarias utilizando material volumétrico verificado para su preparación. Para la preparación de las disoluciones más concentradas utilizar HNO3 de alta pureza de tal forma que la concentración final del ácido sea del 2 al 5% para poder preservar las disoluciones estándar por mayor tiempo, mantener éstas, bien tapadas y en recipientes de PTFE de preferencia.

Para la preparación de las disoluciones de trabajo y de la curva de calibración utilizar HNO3 de alta pureza y la concentración final del ácido debe estar entre 0.1 a 0.2%. Preparar éstas el mismo día del análisis.

Para preparar la solución de trabajo de plata (Ag), disolver la plata en 80 ml de HNO3 (1+1) calentando para lograr la disolución, enfriar y diluir al volumen con agua en un matraz volumétrico de 1000mL. Reservar la solución en una botella cambar sellada completamente con una hoja de aluminio para proteger de la luz.

Para preparar la solución de trabajo de aluminio (Al), disolver el aluminio en 4 mL de HCl (1+1) y 1 mL de HNO3 concentrado en un cubo. Calentar el cubo lentamente para inducir la solución. Transferir la solución cuantitativamente a un matraz volumétrico de 1000 mL. Añadir 10mL de HCl (1+1) y diluir al volumen deseado con agua.

Preparar 5 niveles de concentración dentro del intervalo de trabajo. El intervalo depende de la sensibilidad del instrumento, del tipo de matriz y del uso de modificadores, tomar como guía la Tabla B.4.1-1, de este Apéndice, para un volumen de muestra de 20 µL.

Tabla B.4.1-1. Intervalo de trabajo óptimo para plata y aluminio

Elemento

Masa característica (m0) (pg)

Límite de detección (µg/L)

Intervalo de trabajo (µg/L)

Ag

1.5

0.2

1 a 10

Al

10

1

6 a 60


Preparar una disolución de una concentración conocida de plata o aluminio para verificar el equipo.

B.4.1.6.4 Condiciones de operación del horno de grafito

Ajustar el espectrofotómetro de acuerdo a las recomendaciones del fabricante, encender la lámpara y dejar calentar al menos 15 minutos las LCH y al menos 45 minutos las LDE.

Siempre utilizar la corrección de fondo.

El programa de temperatura del horno de grafito (secado, pirolisis, atomización y limpieza) depende del analito, de la matriz y de la marca del equipo utilizado. Optimizar utilizando como guía las recomendaciones del fabricante. En la Tabla B.4.1-2, de este Apéndice, se muestran los principales parámetros utilizados para ajustar el equipo.

Tabla B.4.1-2. Parámetros de ajuste en el horno de grafito

Elemento

Longitud de onda (nm)

Ancho de rejilla (slit) (nm)

Temperatura de pirolisis (°C)

Temperatura de atomización (°C)

Sin modificador

Con modificador

Sin modificador

Con modificador

Ag

328.1

0.7

650

1 000

1600

2 200

Al

309.3

0.7

1 400

1 700

2500

2 350/2 400


Utilizar modificadores de matriz para eliminar los efectos de matriz ya que su uso permite elevar la temperatura de pirolisis y poder eliminar las interferencias sin que se pierda el analito.

Si se utilizan modificadores de matriz en las muestras, adicionar también al blanco de la curva,  a la curva de calibración, a las disoluciones estándar de verificación, a las muestras fortificadas y a las disoluciones estándar de control de calidad (muestras de control de calidad (MCC) o muestras de control de laboratorio (MCL).

En la Tabla B.4.1-3, de este Apéndice, se muestran los principales modificadores de matriz utilizados en el análisis por horno de grafito. Generalmente la cantidad indicada en la tabla debe estar contenida en un volumen de modificador de 10 µL.

Tabla B.4.1-3. Principales modificadores de matriz utilizados en el análisis por horno de grafito.

Elemento

Modificador químico

Cantidad (µg)

Ag

Pd + Mg(NO3)2 o

NH4H2PO4

15 + 10

200

Al

Pd + Mg(NO3)2 o

Mg(NO3)2

15 + 10

50

Los modificadores y las cantidades pueden variar, se pueden utilizar los recomendados por el fabricante.

Si el equipo cuenta con automuestreador, colocar los puntos de la curva, el blanco de reactivos, las muestras y los modificadores de matriz en los viales, los cuales han sido previamente enjuagados con ácido nítrico al 3% y posteriormente con la disolución a analizar.

B.4.1.6.5 Lectura en el equipo

Leer por triplicado el blanco de calibración para verificar que no haya contaminación y posteriormente leer la disolución de verificación también por triplicado.

Leer por duplicado en el equipo el blanco y los puntos de la curva.

Elaborar una curva de calibración dentro del intervalo de trabajo, graficando la absorbancia (área o altura de pico) en función de la concentración. La absorbancia integrada como área de pico es más recomendable.

Ajustar la curva por medio de mínimos cuadrados (regresión lineal) o calcular la concentración directamente en el equipo que se programe.

Leer cada una de las muestras por duplicado, registrar la absorbancia y calcular la concentración del elemento a partir de la curva de calibración. Cuando se use el equipo programable realizar los cálculos finales.

Asegurarse que las concentraciones de las muestras caen dentro del intervalo de trabajo de la curva de calibración, de no ser así realizar la dilución correspondiente.

B.4.1.6.6 Análisis de datos y cálculos

Interpolar los valores de absorbancia, área o altura del pico de la muestra analizada en la curva de calibración y obtener los resultados en mg/L del elemento en la muestra empleando la siguiente fórmula:

En donde:

A        concentración del elemento en la muestra leída directamente del equipo o de la curva de calibración, en mg/L o µg/L

V        volumen de la disolución de la muestra (aforo), en mL

F        factor para pasar de µg a mg=1 000 (si la curva está en µg/L)

M        volumen de la muestra, en mL

Si la muestra ha sido diluida, debe aplicarse el factor de dilución.

Calcular el porcentaje de recuperación para el analito de acuerdo con la siguiente fórmula:

En donde:

R        % de recobro

CM        Concentración de la muestra fortificada o blanco de reactivos fortificado.

C        Concentración de la muestra o blanco de reactivos.

CA        Concentración equivalente de elemento añadido a la muestra o blanco de reactivos.

B.4.1.6.7 Informe de prueba

Reportar el resultado como mg/L de plata total o mg/L de aluminio.

B.4.1.7 Control de calidad e interferencias

B.4.1.7.1 Control de calidad

El coeficiente de correlación (r) de la curva deberá ser > 0.995. Leer en el equipo el blanco de calibración y un punto de la curva de calibración (MCI) antes de iniciar la lectura de las muestras, después de la lectura de cada 10 muestras y al final del análisis. El resultado deberá encontrarse dentro del ± 15% del valor esperado. Si dicho valor no se encuentra en el intervalo, interrumpir el análisis y buscar las posibles causas, posteriormente volver a leer la curva de calibración y repetir las lecturas del último lote de muestras.

B.4.1.7.2 Interferencias

Altas concentraciones de cloruro pueden causar resultados bajos debido a que la volatilidad de muchos elementos se incrementa y el analito se pierde durante el proceso de pirolisis. Los efectos de matriz pueden disminuirse parcialmente o completamente con la optimización del programa de temperatura, del uso de tubos recubiertos pirolíticamente y plataformas, con el uso de modificadores químicos como el nitrato de magnesio o el fosfato de amonio, la técnica de adición de estándar y con el uso del corrector de fondo.

B.4.1.8 Referencias

International Organization for Standardization. 2003. Water quality- Determination of trace elements using atomic absorption spectrometry with graphite furnace. ISO15586:2003(E).

B.4.2 MÉTODO DE PRUEBA PARA LA DETERMINACIÓN DE ALUMINIO, ANTIMONIO, ARSÉNICO, BARIO, CADMIO, COBRE, CROMO, FIERRO, MANGANESO, NÍQUEL, PLATA, PLOMO Y SELENIO POR ESPECTROMETRÍA DE EMISIÓN ÓPTICA DE PLASMA ACOPLADO INDUCTIVAMENTE (ICP-OES).

B.4.2.1 Símbolos y términos abreviados

Al        aluminio

Ag        plata

As        arsénico

Ba        bario

CCB        Al blanco de calibración continúa.

CCC        A la disolución estándar de verificación de calibración continua, preparada en la misma matriz ácida con la que se prepara el CVI en o cerca del nivel medio de la curva de calibración, la cual se utiliza para verificar la curva de calibración al final de cada lote de análisis y después de cada 10 muestras.

Cd        cadmio

Cr        cromo

CVI        A la disolución preparada en la misma matriz ácida con la que se preparan las disoluciones estándares de calibración. Esta disolución debe ser un estándar independiente cuya concentración debe estar cercana al punto medio del intervalo lineal a una concentración distinta de la utilizada para la calibración del instrumento.

Fe        fierro

FEP        fluorocarbono

HCl        ácido clorhídrico

ICP-OES        Espectrometría de emisión óptica de plasma acoplado inductivamente

IEC        interferencias espectrales

LDI        límites de detección del instrumental

LLCCV        A la disolución preparada en la misma matriz ácida con la que se prepara el CVI en el límite de cuantificación obtenido durante la validación, la cual se utiliza para verificar antes del análisis de las muestras cuando se realiza la curva de calibración inicial con un solo estándar de calibración y un blanco.

LMD        Límite de detección del método

Mn        manganeso

Ni        níquel

Pb        plomo

Sb        antimonio

Se        selenio

Y        itrio

%DER        por ciento de desviación estándar relativa.

B.4.2.2 Principio

La muestra en solución es aspirada (nebulizada) continuamente en un plasma de argón inductivamente acoplado, donde los analitos de interés se convierten en átomos de fase gaseosa de estado excitado o iones. A medida que los átomos o iones de estado excitado vuelven a su estado fundamental, emiten energía en forma de luz a longitudes de onda que son características de cada elemento. La intensidad de la energía emitida a la longitud de onda elegida es proporcional a la cantidad del elemento en la muestra analizada.

Las muestras de agua se conservan mediante tratamiento con ácido y se digieren si es necesario. El análisis directo por ICP-OES debe llevarse a cabo solamente sobre matrices acuosas relativamente limpias.

B.4.2.3 Alcance y aplicación

El método de Espectrometría de emisión óptica de plasma acoplado inductivamente (ICP-OES) utilizando sistemas ópticos simultáneos o secuenciales y un sistema de plasma de vista axial y radial, es utilizado para la determinación de metales, metaloides y algunos elementos no metálicos en disolución acuosa.

La espectrometría de emisión óptica de plasma acoplado inductivamente (ICP-OES) es una técnica espectrométrica utilizada para determinar oligoelementos en soluciones acuosas. En la ICP-OES, una solución de muestra es aspirada (es decir, nebulizada) continuamente en una descarga de argón plasma acoplada inductivamente, donde los analitos de interés se convierten en átomos o iones en fase gaseosa de estado excitado. A medida que los átomos o iones de estado excitado vuelven a su estado fundamental, emiten energía en forma de luz a longitudes de onda que son características de cada elemento específico. La intensidad de la energía emitida a la longitud de onda elegida es proporcional a la cantidad (concentración) de ese elemento en la muestra analizada. Por tanto, determinando las longitudes de onda que son emitidas por una muestra y sus intensidades respectivas, se puede cuantificar la composición elemental de la muestra dada con respecto a un patrón de referencia. Para obtener resultados precisos, el análisis directo de ICP-OES debe llevarse a cabo solamente sobre matrices acuosas relativamente limpias (por ejemplo, muestras de agua subterránea pre-filtradas). Otras muestras acuosas y/o sólidas más complejas necesitan digestión ácida antes de su análisis; El analista debe asegurar que se elija un método de digestión de la muestra que sea apropiado para cada analito y el uso previsto de los datos.

B.4.2.4 Equipos y materiales

Las referencias a marcas específicas y números de catálogo se incluyen sólo como ejemplos y no implican aprobación de los productos. Dicha referencia no excluye el uso de otros proveedores o fabricantes. Las referencias específicas pretenden representar especificaciones adecuadas para los artículos.

Automuestreador.

Balanza analítica, para la preparación de estándares y reactivos.

Embudos

Espectrómetro de emisión controlado a través de una computadora, con capacidad de realizar corrección de fondo.

Matraces volumétricos de diferentes capacidades.

Pipetas volumétricas de pistón de diferentes capacidades.

Espectrometría de emisión óptica de plasma acoplado inductivamente (ICP-OES).

Probetas graduadas

Unidad de microondas que proporcione una energía de 600 a 1600 W, dependiendo del número de muestras de capacidad, que pueda programarse dentro de ±10 W de la energía requerida y que cuente con sensor de temperatura y presión y un controlador de microondas.

El sistema requiere de vasos de digestión de teflón PFA de 75 a 100 mL de capacidad capaces de resistir presiones de 500 psi como máximo y una temperatura máxima de 210 °C.

B.4.2.5 Reactivos y soluciones

A menos que se indique otro grado, los reactivos que se requieren en el método deben ser tipo ACS (American Chemical Society) grado reactivo analítico. Prever que los reactivos sean de la pureza necesaria para permitir su uso sin que afecte la exactitud en la determinación.

Agua tipo I

Ácido clorhídrico concentrado (HCl) con la pureza necesaria para evitar contaminación de las muestras.

Ácido nítrico concentrado (HNO3) con la pureza necesaria para evitar contaminación de las muestras.

Disolución de ácido clorhídrico HCl (1:2). Agregar 500 mL de HCl concentrado a 400 mL de agua contenidos en un matraz volumétrico de 1 L y llevar al volumen.

Disoluciones patrón estándar para cada analito. Estas disoluciones pueden ser compradas o preparadas a partir de productos químicos de ultra-alta pureza (99.99 % o de mayor pureza). Todas las sales deben ser secadas por 1 hora a 105°C, con algunas excepciones específicas anotadas. Muchas sales de metales son extremadamente tóxicas si son inhalados o ingeridos. Lavarse las manos cuidadosamente después de su manejo.

Para la preparación de las disoluciones estándares concentradas típicas proceder conforme a lo siguiente:

Calcular las concentraciones en base al peso de metal puro añadido, o mediante el uso de la fracción del elemento y el peso de la sal de metal añadido.

Disolución concentrada de aluminio, 1 mL = 1 000 µg Al. En un vaso disolver 1.0 g of aluminio metálico con 4.0 mL de HCl (1:1) y 1.0 mL de HN03 conc. Calentar lentamente para disolver el metal. Una vez que se haya disuelto completamente, transferir la disolución cuantitativamente a un matraz volumétrico de 1 000 mL, agregar 10.0 mL de HCl (1:1) y diluir al volumen con agua grado reactivo.

Disolución concentrada de antimonio, 1 mL = 1 000 µg Sb. En un matraz volumétrico de 1 000 mL, disolver 2.667 3 g de K (SbO)C4H4O6 (fracción del elemento Sb = 0.374 9), con agua grado reactivo, adicionar 10 mL de HCl (1:1), y diluir al volumen con agua.

Disolución concentrada de arsénico, 1 mL = 1000 µg As. En un matraz volumétrico de 1 000 mL disolver 1.320 3 g de As2O3 (fracción del elemento As = 0.757 4), con 100 mL de agua conteniendo 0.4 g de NaOH. Acidificar la disolución con 2 mL de HNO3 conc. y diluir al volumen con agua.

Disolución concentrada de Bario, 1 mL = 1 000 µg de Ba. En un matraz volumétrico de 1 000 mL disolver 1.516 3 g de BaCl2 (fracción del elemento Ba = 0.659 5), previamente secado a 250 °C por 2 horas con 10 mL de agua y 1 mL de HCl (1:1). Adicionar 10 mL más de HCl (1:1) y diluir al volumen con agua.

Disolución concentrada de Cadmio, 1 mL = 1 000 µg Cd. En un matraz volumétrico de 1 000 mL disolver 1.142 3 g de CdO (fracción del elemento Cd = 0.875 4), en una cantidad mínima de HNO3 (1:1). Calentar para incrementar la velocidad de disolución. Adicionar 10 mL de HNO3 concentrado y diluir al volumen con agua.

Disolución concentrada de Cobre, 1 mL = 1 000 µg Cu. En un matraz volumétrico de 1 000 mL disolver 1.256 4 g de CuO (fracción del elemento Cu = 0.798 9) en una cantidad mínima de HNO3 (1:1). Adicionar 10 mL de HNO3 concentrado y diluir al volumen con agua.

Disolución concentrada de Cromo, 1 mL = 1 000 µg Cr. En un matraz volumétrico de 1 000 mL disolver 1.923 1 g de CrO3 (fracción del elemento Cr = 0.520 0), en agua. Cuando se haya disuelto acidificar  con 10 mL de HNO3 concentrado y diluir al volumen con agua.

Disolución concentrada de Fierro (1 000 µg/mL Fe) - En un matraz volumétrico de 1 000 mL disolver 1.429 8 g de Fe2O3 en una mezcla caliente de 20 mL de HCl al 50 % y 2 mL de HNO3 concentrado. Diluir al volumen con agua.

Disolución concentrada de Itrio, 1 mL = 1 000 µg Y. En un matraz volumétrico de 1 000 mL disolver 4.308 1 g de Y(NO3)3.6H20 (fracción del elemento Y = 0.232 1), en una cantidad mínima de HNO3 diluido. Adicionar 10 mL de HNO3 concentrado y llevar al volumen con agua.

Disolución concentrada de Manganeso, 1 mL = 1 000 µg Mn. En un matraz volumétrico de 1 000 mL disolver 1.0 g de manganeso metálico, en una mezcla ácida (10 mL de HCl concentrado y 1 mL de HNO3 concentrado) y llevar al volumen con agua.

Disolución concentrada de Níquel, 1 mL = 1 000 µg Ni. En un matraz volumétrico de 1 000 mL disolver 1.0 g de níquel metálico en 10 mL de HNO3 concentrado caliente, y llevar al volumen con agua.

Disolución concentrada de Plata, 1 mL = 1 000 µg Ag. En un matraz volumétrico de 1 000 mL, disolver 1.574 8 g AgNO3 (fracción del elemento Ag = 0.635 0), agua, agregar 10 mL de HNO3 concentrado y llevar al volumen con agua.

Disolución concentrada de Plomo, 1 mL = 1 000 µg Pb. En un matraz volumétrico de 1 000 mL disolver 1.598 5 g de Pb(NO3)2 (fracción del elemento Pb = 0.625 6), en una cantidad mínima de HNO3 (1:1). Adicionar 10 mL más de HNO3 (1:1) y diluir al volumen con agua.

Disolución concentrada de Selenio, 1 mL = 1 000 µg Se. No secar. En un matraz volumétrico de 1 000 mL disolver 1.633 2 g de H2SeO3 (fracción del elemento Se = 0.612 3) en agua, y llevar al volumen con agua.

Soluciones multielemento, con trazabilidad a NIST comercialmente disponibles, pueden utilizarse para preparar la curva de calibración.

B.4.2.6 Procedimiento

B.4.2.6.1 Preparación de las muestras

Es la responsabilidad del laboratorio cumplir con todas las disposiciones aplicables en materia de manejo de residuos, particularmente las reglas de identificación, almacenamiento y disposición de residuos peligrosos.

Asegurarse que todo el material utilizado durante el análisis esté libre de contaminación mediante procedimientos de lavado y descontaminación con ácido. Para descontaminar los vasos de digestión se puede utilizar un programa de digestión con el horno de microondas siguiendo las instrucciones del manual del fabricante.

Si la muestra es incolora, transparente y no presenta turbiedad aparente, no se requiere realizar digestión, sólo adicionar un volumen apropiado de ácido nítrico para ajustar la concentración del ácido al 1% (v/v). Las muestras de control de calidad (ejemplo blanco de calibración, blanco de reactivo), deben someterse a los mismos procedimientos que las muestras incluyendo la adición del estándar interno o igualar la matriz con las disoluciones estándar.

En caso de que la muestra presente turbiedad, llevar a cabo la digestión de la muestra. Medir una alícuota de 45 mL de muestra homogénea (AGITAR VIGOROSAMENTE LA MUESTRA), y depositar dentro de los vasos de digestión. Tomar 25 mL ó 10 mL de muestra + 20 mL de agua tipo I en caso de que la muestra presente materia orgánica o sólidos suspendidos. Adicionar 4 mL de HNO3 y 1 mL de HCl a cada vaso, tapar y colocar los vasos en el carrusel del horno de microondas. Proceder con la digestión de las muestras utilizando la potencia, rampas de temperatura y tiempo de acuerdo a las recomendaciones del proveedor. Preparar un blanco de reactivos utilizando agua tipo I en lugar de muestra y proceder de la misma manera.

Una vez realizada la digestión permitir que los vasos se enfríen aproximadamente 5 minutos antes de sacar el carrusel del horno, posteriormente sacar el carrusel del horno y permitir que los vasos alcancen la temperatura ambiente (de 30 a 40 min) antes de destaparlos.

Destapar cuidadosamente cada vaso dentro de la campana de extracción. Llevar la muestra a un volumen final de 50 mL, si la muestra digerida contiene partículas las cuales puedan obstruir el nebulizador, filtrar utilizando papel filtro Número. 2, 40 ó 41, posteriormente transferir a un tubo previamente etiquetado.

B.4.2.6.2 Análisis de las muestras en el ICP-OES

Calibrar el instrumento de acuerdo con los procedimientos recomendados por el fabricante, utilizando la mezcla de disoluciones estándar de calibración. Enjuagar el sistema con el blanco de calibración entre cada estándar o como recomienda el fabricante.

Enjuagar el sistema con la disolución blanco de calibración, leer el CVI, el blanco de reactivos y las muestras. Enjuagar el sistema con la disolución blanco de calibración antes del análisis de cada muestra. El tiempo de lavado debe ser un minuto. Una reducción de este tiempo de enjuague deberá demostrarse adecuadamente. Registrar los resultados.

Cuando la calibración inicial se realiza utilizando un solo nivel alto y el blanco de calibración, además del CVI, se debe analizar un LLCCV antes del análisis de las muestras. Analizar después de cada diez muestras y al final del lote de análisis un CCC y un CCB.

B.4.2.6.3 Análisis de datos y cálculos

Reportar directamente los datos generados del instrumento con su factor de dilución en caso de que exista considerando lo siguiente:

Cuando se tenga un %DER mayor del 10 %, pero éste se deba a una lectura errónea de las 3 réplicas realizadas por el equipo, verificar si esa lectura se debió a un error del equipo, en cuyo caso considerar las otras 2 lecturas y evaluar si los resultados son válidos para ser reportados.

Cuando se tenga un %DER menor del 10 % y el valor de la concentración reportada sea mayor que el LDM, verificar que el pico de respuesta del equipo corresponde al metal en cuestión, en cuyo caso se debe reportar la concentración obtenida, de lo contrario reportar como "no detectado" y especificar el valor del límite de detección. Para esto comparar el pico del metal en cuestión sobreponiendo el pico correspondiente del estándar de calibración de concentración más cercana.

B.4.2.6.4 Informe de prueba

Reportar los resultados de las muestras en mg/L

B.4.2.7 Calibración e interferencias

B.4.2.7.1 Calibración

B.4.2.7.1.1 Mezcla de disoluciones estándar de calibración

Preparar una mezcla de disoluciones estándar de calibración de acuerdo con la Tabla B.4.2.-1., mediante la combinación de volúmenes apropiados de las soluciones concentradas. Tener cuidado al preparar la mezcla de estándares para asegurar que los elementos son compatibles y estables juntos. Transferir las disoluciones estándar a envases de fluorocarbono (FEP) o envases de polietileno o polipropileno que no hayan sido utilizados previamente para almacenar. Para todas las disoluciones estándar intermedios y de trabajo, especialmente estándares con una concentración baja (<1 mg/L o ppm), debe demostrarse su estabilidad antes de su uso. Preparar la mezcla de estándares con la periodicidad requerida, tomando en cuenta que la concentración puede cambiar con el tiempo. En la Tabla B.4.2-1 se muestran algunas combinaciones típicas de mezclas de disoluciones estándar de calibración.

Tabla B.4.2.-1. Mezcla de disoluciones estándar de calibración

Disolución

Elementos

I

Cd, Mn, Pb, Se